动物细胞制药课件.pptVIP

⒊貼壁-懸浮培養⑴微載體培養⑵包埋和微囊培養⑶結團培養1、懸浮培養適合非貼壁依賴細胞、兼性貼壁細胞操作簡便、培養條件均一、傳質和傳氧較好、易擴大培養規模細胞體積小、難採用灌流培養、細胞密度低通氣攪拌罐式與氣升式生物反應器6、Namalwa從肯雅患有淋巴瘤病人獲取，建成的人的類淋巴母細胞。2.8%的高倍體率，12～14條標記染色體。單條X，無Y。培養基為RPMI1640+7%胎牛血清。用於生產α干擾素。7、SP2/0-Ag14通過融合的方法從有羊抗紅細胞活性的BALB/c小鼠的脾細胞和骨髓瘤細胞系P3X63Ag8融合雜交瘤SP2/NL-Ag亞克隆中分離獲得，能耐受8氮鳥嘌呤20μg/ml但在含HAT選擇培養基中不能存活。通常用培養基為DMEM+10%胎牛血清。用於生產單抗雜交瘤細胞和抗體。8、Sf-91983年從親代IPLB—SF21AE中克隆形成。親代細胞從秋粘蟲的蛹卵組織中分離獲得。它對苜宿尺蠖核型多角體病毒和其他杆狀病毒高度敏感。通常用的培養基為Grace培養基，添加3.3g/L水解乳蛋白和3.3g/L酵母浸液,10%胎牛血清。用於高效表達外來蛋白製品。9、C127RⅢ小鼠乳腺腫瘤細胞，適合帶有牛乳頭瘤病毒載體的轉染後細胞形態發生顯著變化。生產重組人生長激素。10、COS細胞用複製起點缺失SV40的基因組DNA轉化非洲綠猴腎細胞CV-1獲得三個細胞系：COS-1、COS-3、COS-7廣泛應用於暫態表達系統。11、MDCK來源於成年雌性西班牙長耳狗的腎臟；貼壁型上皮細胞；支持多種病毒增殖；生產獸用疫苗。四、基因工程細胞構建和篩選在生產中採用更多的更有前景的是融合細胞及採用基因工程構建的各種工程細胞。被用構建工程細胞的動物細胞有：CHO-dhfr、BHK-21、Namalwa、Vero、SP2/0、Sf-9等細胞。1、真核細胞基因表達載體的構建使用的載體有兩類：（一）病毒載體牛痘病毒、腺病毒、逆轉錄病毒、杆狀病毒（二）質粒載體：穿梭質粒載體牛痘病毒：用構建多價疫苗腺病毒、逆轉錄病毒：用於基因治療。杆狀病毒：用於外源基因表達。杆狀病毒作為載體的優點：①雙鏈DNA，易重組②插入7～8kbDNA不影響正常病毒粒子的形成。③多角體蛋白和病毒粒子的形成無直接關係，因此用外源基因更換多角體蛋白基因，仍能形成有感染力病毒粒子；④多角體蛋白基因有非常強的啟動子，產生的蛋白質可占全部蛋白質的20%～30%；⑤用光學顯微鏡可看到多角體，可以此作為標記物，選陽性克隆。⑥如用家蠶杆狀病毒，還可在蠶體表達外源基因。質粒載體在細菌和哺乳動物細胞體內都能擴增。都含有如下基本成分：①允許載體在細菌體內擴增的質粒序列。②含有使基因表達的調控元件。③能用以篩選出外源基因已整合的選擇標記。④有時還帶有選擇性增加拷貝數的擴增系統。2、基因載體的導入和高效表達

工程細胞株的篩選基因載體導動物細胞常用方法是：磷酸鈣沉澱法電穿孔法磷酸鈣沉澱法：溶解的DNA加Na2HPO4和CaCl2形成磷酸鈣沉澱，DNA被包在磷酸鈣沉澱中，形成DNA—磷酸鈣共沉澱物，當和細胞表面接觸時，則通過細胞吞噬作用而將DNA導入。電穿孔法：借助電穿孔儀的高壓脈衝電場，使細胞膜出現暫態可逆性小孔，外源DNA沿小孔進入細胞。轉化率較高，拷貝數低。五、細胞庫的建立生產用的工程細胞必須建立兩個細胞庫：⒈原始細胞庫⒉生產用細胞庫原始細胞庫貯存時須有該細胞的詳細擋案，包括：①該細胞系的歷史②該細胞系的特性③對各種有害因數的檢查結果生產用細胞庫從原始細胞庫來的，或從單一安瓿來，或從多個安瓿來即刻混合，經培養擴增再分裝儲存形成細胞庫。需建擋案，進行無菌性無細胞交叉污染的檢查。需確定最高使用的傳代數。第四節動物細胞的培養條件與培養基細胞體外培養基本條件:①無菌②營養充足，防止有害物質③氧氣④隨時清除代謝有害物質⑤良好的生存外環境⑥及時分種一、動物細胞的培養條件1、器材的清洗和消毒浸泡、刷洗、泡酸、沖洗組分強酸次強酸弱酸重鉻酸鉀/g63120100硫酸/ml1000200100水/ml