动物细胞制药课件.pptVIP

BHK-21:地鼠幼鼠腎臟中分離的;成纖維樣細胞,核型為2n=44;培養基為DMEM加7%胎牛血清。用於增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒、狂犬病毒等並製作疫苗，現已用於工程細胞構建。成功案例：重組凝血因數Ⅷ，治療甲型血友病。C127細胞：是源自RIII小鼠乳癌的未經轉化的克隆株。最近常用作牛乳頭瘤病毒DNA質粒轉化的合適受體。450元。成功案例：重組人生長激素動物細胞工程制藥第一節概述細胞學說的建立組織培養和細胞培養細胞工程學施萊登施旺第二節動物細胞的形態

和生理特點一、動物細胞的形態適應功能,形態各異。離體培養細胞分兩類：貼壁細胞懸浮細胞⒈貼壁細胞生長須有貼附的支持物表面，自身分泌或培養基中提供的貼附因數才能在該表面上生長。兩種形態：成纖維細胞型上皮細胞型⒉懸浮細胞生長不依賴支持物表面，在培養液中呈懸浮狀態生長。如淋巴細胞。⒊兼性貼壁細胞生長不嚴格依賴支持物。如中國地鼠卵巢細胞，小鼠L929細胞。二、動物細胞的化學組成和代謝動物細胞的化學組成動物細胞的代謝三、動物細胞的生理特點⒈細胞的分裂週期長細胞分裂時間為12～48h。⒉細胞生長需貼附於基質,並有接觸抑制現象。⒊正常二倍體細胞的生長壽命是有限的。原代培養有限細胞系無限細胞系⒋動物細胞對周圍環境十分敏感;對理化因素敏感，如：滲透壓、pH、離子濃度、剪切力、微量元素等。⒌動物細胞對培養基要求高必需氨基酸、維生素、無機鹽、微量元素、葡萄糖、細胞生長因數、貼壁因數等。⒍動物細胞對蛋白質的合成途徑和修飾功能與細菌不同。動物細胞蛋白質的合成部位：游離核糖體合成蛋白質用於細胞質基質內。粗面內質網的核糖體合成蛋白質是分泌性的和膜中的整合蛋白多為糖蛋白。動物細胞生產藥物缺點:培養條件高、成本貴、產量低。優點:分泌胞外、純化方便、翻譯後修飾糖基化，與天然產品一致。第三節生產用動物細胞的

要求和獲得一、生產用動物細胞的要求原代細胞二倍體細胞系轉化細胞系二、生產用動物細胞的獲得⒈原代細胞是直接取自動物組織器官,經過粉碎消化而獲得的細胞懸液（109/g）。需要大量動物，費錢費勞力。雞胚細胞、原代兔腎細胞、鼠腎細胞、淋巴細胞。⒉二倍體細胞系原代細胞經過傳代篩選克隆，從多種細胞成分的組織中，挑選並純化出某種具有一定特徵的細胞株。二倍體細胞有正常細胞的特點：①染色體組型是2n核型；②貼壁依賴接觸抑制；③可傳代培養50代；④無致瘤性。二倍體細胞⒊轉化細胞系通過某個轉化過程形成的，常由於染色體斷裂變成異倍體，失去正常細胞特點，而獲得無限增殖能力。轉化過程可以是自發的，和人工的，從腫瘤組織中。4.融合細胞系細胞融合是指兩個或以上的細胞合併成一個細胞的過程。仙臺病毒融合法聚乙二醇融合法電融合法5.重組工程細胞系三、基因工程細胞構建和

篩選被用構建工程細胞的動物細胞有：CHO-K1、BHK-21、C127、COS、Namalwa、Vero、Sf-9及多種骨髓瘤細胞。⒈真核細胞基因表達載體的構建使用的載體有兩類：㈠病毒載體牛痘病毒、腺病毒、逆轉錄病毒、杆狀病毒㈡質粒載體牛痘病毒：用構建多價疫苗腺病毒、逆轉錄病毒：用於基因治療。杆狀病毒：用於外源基因表達。杆狀病毒作為載體的優點：①雙鏈DNA，易重組②插入7～8kbDNA不影響正常病毒粒子的形成。③多角體蛋白和病毒粒子的形成無直接關係，因此用外源基因更換多角體蛋白基因，仍能形成有感染力病毒粒子；④多角體蛋白基因有非常強的啟動子，產生的蛋白質可占全部蛋白質的20%～30%；⑤用光學顯微鏡可看到多角體，可以此作為標記物，選陽性克隆。⑥如用家蠶杆狀病毒，還可在蠶體表達外源基因。質粒載體在細菌和哺乳動物細胞體內都能擴增。都含有如下基本成分：①允許載體在細菌體內擴增的質粒序列。②含有使基因表達的調控元件。③能用以篩選出外源基因已整合的選擇標記。④有時還帶有選擇性增加拷貝數的擴增系統。⒉基因載體的導入和高效表達工程細胞株的篩選磷酸鈣沉澱法：溶解的DNA加Na2HPO4和CaCl2形成磷酸鈣沉澱，DNA被包在磷酸鈣沉澱中，形成DNA－磷酸鈣共沉澱物，當和細胞表面接觸時，則通過細胞吞