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动物源胰激肽释放酶纯化工艺与策略优化研究

一、引言

1.1研究背景与意义

胰激肽释放酶（Kallikrein）作为一种丝氨酸蛋白酶，在生物医药领域占据着举足轻重的地位。其主要功能是通过对激肽原的水解，生成具有生物活性的激肽，进而发挥一系列重要的生理作用。激肽具有扩张血管的能力，能够使血管平滑肌松弛，增加血管内径，从而有效地降低血压，对高血压患者的血压调控起到积极作用。同时，它还能显著改善血液循环，优化血液在全身的流动分布，确保各个组织和器官获得充足的血液供应，对于微循环障碍疾病，如糖尿病周围神经病变引发的微循环异常，有着良好的治疗效果。

在临床应用方面，胰激肽释放酶展现出了广泛的适用性和显著的疗效。它被用于治疗多种心脑血管疾病，如冠心病、心绞痛等，通过改善心肌供血，缓解患者的症状，降低心血管事件的发生风险。在男性不育症的治疗中，也发挥着关键作用，能够调节生殖系统的局部血液循环，为精子的生成和发育提供良好的微环境，提高精子的质量和活力。此外，对于美尼尔氏综合症，它可以调节内耳的微循环，减轻膜迷路积水，缓解眩晕、耳鸣等症状。

目前，用于临床的激肽释放酶药品主要来源于猪胰脏的提取，少量为人尿激肽释放酶。从猪胰脏中提取激肽释放酶已有数十年历史，但现有分离方法仍存在诸多不足，如得率低、操作繁琐、周期长等，限制了其大规模生产和应用。牛胰激肽释放酶也被证实具有降血压和调节血液循环的作用，然而其纯化研究尚不够深入，亟待进一步探索。

动物源胰激肽释放酶的纯化研究具有至关重要的意义。在医药产业中，高纯度的胰激肽释放酶是制备高质量药品的关键原料，直接关系到药品的疗效和安全性。通过优化纯化工艺，提高胰激肽释放酶的纯度和得率，能够降低生产成本，提高生产效率，满足日益增长的临床需求。从经济价值角度来看，高效的纯化技术有助于提升产品竞争力，拓展市场份额，为相关企业带来显著的经济效益。对于推动生物医药领域的技术进步和创新发展也具有积极的促进作用，为开发更多新型的治疗药物和治疗方法奠定基础。

1.2国内外研究现状

在动物源胰激肽释放酶纯化领域，国内外学者已开展了大量研究，取得了一系列重要成果，但也面临着诸多挑战。

国外在胰激肽释放酶纯化技术的研究起步较早，技术相对成熟。传统的纯化方法如盐析法，利用不同蛋白质在高浓度盐溶液中溶解度的差异进行分离。硫酸铵盐析是较为常用的手段，它操作简单、成本较低，能初步富集胰激肽释放酶。然而，该方法的分辨率有限，得到的产物纯度不高，往往需要结合其他方法进一步纯化。

层析技术在国外的应用也十分广泛。离子交换层析依据蛋白质表面电荷性质和数量的不同进行分离，阴离子交换层析（如DEAE配基）和阳离子交换层析（如CM配基）常被联合使用。法国GrahamS.Bailey的研究采用阴离子交换结合阳离子交换，最后加一步凝胶过滤层析的方法，虽经过三步纯化后胰激肽释放酶比活高达1254U/mg，但收率仅为28.4%。这是因为在离子交换过程中，通过改变pH来洗脱胰激肽释放酶，由于缓冲液的缓冲作用，柱内pH改变缓慢，导致周期延长，且耗费大量缓冲液。疏水层析利用蛋白质与疏水介质之间的疏水相互作用进行分离，在高盐浓度下，蛋白质的疏水区域与疏水介质结合，通过降低盐浓度实现洗脱。该方法与盐析法结合具有一定优势，如英国TalalS.EI.Thaher的研究，采用离子交换层析与疏水层析结合，收率达到87%，但胰激肽释放酶比活只有156.3U/mg，且步骤较多、纯化周期较长、成本较高。

国内在胰激肽释放酶纯化方面也取得了显著进展。一些研究致力于优化传统工艺，提高产品的纯度和得率。李冲峰等人将疏水层析技术用于从猪胰脏中分离纯化激肽释放酶，建立了盐析与疏水层析相结合的方法。将粗品溶解后经过硫酸铵沉淀处理，然后通过ButylSepharoseFF疏水层析，得到的目标蛋白纯度大于500U/mg，盐析和疏水两步纯化的收率大于85.0%。该工艺与传统工艺相比，操作简单、快速，回收率和纯化倍数高，有望成为从动物组织中快速分离纯化药用蛋白质的有效技术平台。赵佳的研究则针对猪胰激肽释放酶，通过实验比较凝胶过滤、疏水层析以及阴离子交换层析三种方法，筛选出经济实用的QAE-Sephadex阴离子介质，单独使用可一步纯化出比活为342.5U/mg的激肽释放酶，比丙酮粗粉比活提高了34.52倍，活性回收率为60.8%。对于牛胰激肽释放酶，确定了将CM-SepharoseCL-6B阳离子柱与Butyl-Sepharose4FF疏水柱联用的较优生产工艺，得到比活为667.0U/mg的牛胰激肽释放酶，比粗粉比活提高了8.52倍，回收率为51.6%。

尽管国内外在动物源胰激