转基因动物与生物反应器OK.pptVIP

第30页，共84页，星期日，2025年，2月5日第31页，共84页，星期日，2025年，2月5日（五）体内接种（1）在手术前夜令受体母鼠与已结扎输精管雄性小鼠合笼，次日晨取出雌鼠备用；（2）取注射吸管两支，分别作为向两侧输卵管注入胚卵之用；先吸入少许培养液，排出后留少许液体并保留一两个气泡，继之吸入胚卵数个(在管腔内成串)；最后仍保留一个气泡，以使管内胚卵限制于气泡之间不易移动并利于识别；第32页，共84页，星期日，2025年，2月5日（3）麻醉小鼠，深度适当，置动物于小手术平台上，呈腹卧位(背朝上)；（4）剪出背肾部两侧毛，碘酒／酒精消毒；（5）使动物躯干部一侧斜向上，在髂骨和肾脏下方间剪一纵切口，长2cm；（6）轻轻牵出输卵管，找寻输卵管口(刚排卵动物输卵管壶腹部微膨胀，内可见成团未受精卵子)一手用镊子轻轻持住输卵管系膜，另一只手持一个含有胚卵的注入管，伸入输卵管口内，把吸管内已含有外源DNA的胚卵全部注入输卵管内；（7）把输卵管及周围组织送回腹腔内；（8）仔细紧密缝合创口，（9）再令动物倒向另侧；按同样操作方法向该侧输卵管内输入同等量的胚卵。第33页，共84页，星期日，2025年，2月5日第34页，共84页，星期日，2025年，2月5日（六）显微注射法获得转基因鼠的成活率第35页，共84页，星期日，2025年，2月5日优点：转基因范围广，转移基因大，可达数百kb；且转基因不含任何病毒基因组片段，绝对安全。缺点：整合机制不明确，无规律随机整合，多拷贝整合导致转基因不表达；整合位点随机会造成转动物基因组的重排、突变、易位缺失等；需显微操作仪，技术性要求强。第36页，共84页，星期日，2025年，2月5日二、胚胎干细胞方法第37页，共84页，星期日，2025年，2月5日胚胎干细胞（embryonicstemcell，ES）是从早期胚胎内细胞团（ICM）分离出来的，能在体外培养的一种高度未分化的多能干细胞。它是一种含正常二倍体染色体的具有发育全能性的细胞。可以在体外进行人工培养，扩增，并能以克隆的形式保存。第38页，共84页，星期日，2025年，2月5日第39页，共84页，星期日，2025年，2月5日第40页，共84页，星期日，2025年，2月5日（一）ES细胞的建立与维持动物的准备：取受精之后3.5天的母鼠分离鼠胚。胚胎的分离和初培养：3.5天孕鼠鼠断颈处死解剖小鼠取出胚胎体外培养胚胎4—6天后，离散ICM。ICM的离散与ES的分离：分离ICM酶解细胞团培养离散细胞ES细胞集落ES细胞的扩增：离散ES细胞置四孔培养板中培养ES细胞的常规培养：ES细胞由四孔板转至培养皿进行常规培养第41页，共84页，星期日，2025年，2月5日第42页，共84页，星期日，2025年，2月5日（二）ES细胞的基因组操作将外源基因移入到ES细胞基因组后，既能高效稳定表达，又不影响ES细胞的各种功能。这就要求目的基因必须要定点参入，并且参入整合后，对原有基因结构及功能没有影响或影响最小。第43页，共84页，星期日，2025年，2月5日与整合位点两端区域同源的两段DNA序列（HB1和HB2）转入的目的基因（TG）编码抗G418的新霉素磷酸转移酶基因（neor）两个不的胸苷激酶基因（HSV-tk1和HSV-tk2）第44页，共84页，星期日，2025年，2月5日（三）转基因ES细胞的筛选——正负选择法正选择法筛选出转基因整合型ES细胞：通过物理方法将重组DNA分子导入ES细胞，在含有抗菌素G418的培养基中，没有整合外源基因的细胞将全部死亡，只有整合了外源基因的细胞才可以存活下来。负选择法筛选出特异整合型ES细胞：如果非特异性整合发生，则两个tk基因或其中一个基因很大可能与TG和neor一起整合，这时用GCV筛选，tk基因表达的胸苷激酶能反GCV转化成有毒的化合物，使细胞死亡。这是负选反择。第45页，共84页，星期日，2025年，2月5日（四）转基因ES细胞的检测第46页，共84页，星期日，2025年，2月5日（五）转基因小鼠的繁育正确