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第三章细胞工程基本技术

一、细胞工程实验室的设置1动物细胞工程实验室的设置无菌操作室：更衣间、缓冲间、操作间培养观察室制备室储藏室清洗与灭菌室

植物细胞工程实验室的设置除与动物细胞工程实验室相同的设置外，还有些特殊要求，如光照、试管苗培育和移植驯化等。

2017超净工作台012018倒置显微镜和相差显微镜022019干燥箱032020水纯化装置042021冰箱（4℃、-20℃、-70℃）052022压力蒸汽消毒器06二、常用仪器与设备

细胞记数板和电子细胞记数仪01过滤除菌装置02离心机03移液管、吸管04离心管05移液器06天平07

显微操作仪细胞融合仪培养箱二氧化碳培养箱，提供恒定CO2（5%）以稳定pH值，温度：哺乳类35℃-37℃，鸟类38.5℃，气相：O2、CO2010302动物细胞工程实验室基本设备仪器

细胞冷冻储存器（程序化冷冻仪和液氮罐-196℃）01培养用器皿各种培养瓶、培养皿、多孔培养板（6、24、96）手术器械等02

植物细胞工程实验室基本设备仪器01光照培养箱人工气候室摇床培养瓶02

根据密封程度的不同,将生物安全分为四个等级,即:P1、P2、P3、P4（protect）一般细胞培养按一级生物安全标准，其基本要求是：限制随便出入实验室；2、操作前后要消毒；3、不能用口吸取液体；4、禁止在室内进食、吸烟和存放食品；5、操作时着专门实验服；6、处理细胞前后要洗手；7、操作时在超净工作台。1234三、实验室的生物安全

01在培养物中无毒和无菌是保证培养细胞生存的首要条件，因此对培养器皿的清洗和灭菌是极为重要的环节。02清洗的目的是清除杂质和微生物,使器皿内不残留任何影响细胞生长的成分(有害物质、微生物、细胞碎片及非营养性化学成分）。四、培养用品的清洗

在细胞培养中，工作量最大的是玻璃器皿的清洗。清洗后的玻璃器皿不仅要求干净透明、无油迹，而且不能残留任何物质。某些化学物质仅百万分之一毫克，就会对细胞产生毒性作用。因此，玻璃器皿的清洗必须严格按照程序进行。一般玻璃器皿的清洗包括：浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤。1、玻璃用品的清洗

初次使用和培养用后的玻璃器皿都需先用清水浸泡，以使附着物软化或被溶掉。培养后的玻璃器皿多附有大量蛋白质，用完后应立即初步刷洗，浸泡在蒸馏水中，注意让水完全进入瓶皿中，不要留有气泡。使用新的器皿应先用自来水简单刷洗，然后用稀盐酸(5％)浸泡过夜或煮沸30分钟，中和其中的碱性物质后再清洗。①浸泡浸泡后的玻璃器皿要用软毛刷和优质洗涤剂（加热）刷洗。②刷洗

浸酸01刷洗不掉的极微量杂质经过清洗液浸泡的强氧化作用可被除掉。清洗液对玻璃器皿无腐蚀作用，去污十分有效，是清洗过程中关键环节。清洗液是由重铬酸钾、浓硫酸和水按一定比例配制而成。浸泡时器皿要充满洗液，不留气泡。浸泡时间不应少于6小时，一般应浸泡过夜。02

清洗液可根据需要，配制成不同强度：常用的有下面三种：强液：重铬酸钾63g，浓硫酸1000ml，蒸馏水200ml次强液：重铬酸钾120g，浓硫酸200ml，蒸馏水1000ml弱液：重铬酸钾l00g，浓硫酸l00ml，蒸馏水1000ml配制时先将重铬酸钾完全溶解于水，然后缓慢加入浓硫酸。新配制的清洁液为棕红色，经多次使用，水份增多或遇有机溶剂时成为绿色，这时表示清洁液已失效，应废弃而重新配置。也可以使用10％～40％的硝酸溶液。

1冲洗2玻璃器皿浸酸后必须用流水充分冲洗，每个器皿用流水灌满、倒掉，必须重复十次以上，不留任何残迹。最后用蒸馏水漂洗2~3次，用双蒸水漂洗1次，烤干备用。3玻璃滤器原则上与玻璃器皿清洗相同。无论是浸泡还是浸酸、冲洗，都需用抽滤的方法。

橡塞清洗新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先用自来水冲洗。胶塞类橡胶用品，每次用后先用蒸馏水浸泡，然后用2％NaOH煮沸10-20min，用自来水冲洗干净，再用1％稀盐酸浸泡30min，用自来水冲洗、蒸馏水漂洗2-3次，最后双蒸或三蒸水漂洗1次，晾干后备用。

1塑料器皿的清洗2细胞培养使用的塑料器皿主要有培养板、培养皿及培养瓶等。这些产品主要是进口的一次性商品，己消毒灭菌，打开就可使用。3如想反复使用，清洗方法如下：用后立即用流水清洗或浸泡在水中，用脱脂棉清拭掉残留附着物，用2％NaOH浸泡过夜，流水冲净后再用5％盐酸浸泡30min，自来水冲洗、蒸馏水漂洗2~3次，最后三蒸水漂洗2次，晾干备用。

01防止细菌、真菌和病毒等微生物的污染。03物理法包括：湿热(高压蒸气)、干热、过滤和紫外线等方法杀灭或去除微生物。04化学法是使用化学消毒剂、抗菌素等杀灭微生物。02消毒灭菌的方法有多种，随物品不同，采用不同的方法。总的来说有物理方法和