第二三节凝胶过滤与高效液相色谱.pptVIP

流速除与柱长度有关外，还与柱直径大小有关。为了防止层析柱中洗脱液流干，可按图5-10装置进行操作。*第62页，共102页，星期日，2025年，2月5日*第63页，共102页，星期日，2025年，2月5日一般说来，洗脱流速慢，分离效果就好(见图5-5及5-11)，但是太慢时也会因扩散加剧而降低分离效果。加样后，经洗脱收集到的每管洗脱液，可选用适当的方法进行定性和定量测定。

*第64页，共102页，星期日，2025年，2月5日洗脱体积的计算峰洗脱体积：是指被分离物质通过凝胶柱所需洗脱液有体积，常用Ve表示。当使用样品的体积很少时，(与洗脱体积比较可以忽略不计)，在洗脱图中，从加样到峰顶位置所用洗脱液体积为Ve。当样品体积与洗脱体积比较不能忽略时，洗脱体积计算可以从样品体积的一半到峰顶位置。当样品很大时，洗脱体积计算可以从应用样品开始到洗脱峰升高的弯曲点(或半高处)。*第65页，共102页，星期日，2025年，2月5日分子量与洗脱体积的关系在凝胶分离范围之内，蛋白质分子量与洗脱位置之间存在线性对应关系。在一定分子量范围内洗脱体积对分子量的对数为线性关系，即分子量的标准曲线。*第66页，共102页，星期日，2025年，2月5日（四）凝胶柱的再生和保存?1．再生仅使用一次的凝胶柱，通常进行重新平衡后即可使用。但使用过多次后，由于凝胶床体积变小，流动速度降低或污染杂质过多等原因，致使其正常性能受到影响。在此情况下，再生方法是：先用水反复进行逆向冲洗。再用缓冲液进行平衡。平衡毕，即可重复使用；另一种方法是，把凝胶倒出，用低浓度的酸或碱按其预处理方法进行，处理后重新装柱即可再行使用。*第67页，共102页，星期日，2025年，2月5日

2．保存使用过的凝胶柱，若要短时间保存，则需进行反复洗涤除去蛋白质等杂质，并加入适当的防霉剂；若要长时间保存，则需将凝胶从柱中取出，进行洗涤、脱水和干燥。其方法：将凝胶用低浓度的酸或碱溶液短时间浸泡后，再用水反复洗涤过滤抽干，并浸泡在浓度稍高的乙醇溶液中。*第68页，共102页，星期日，2025年，2月5日如此依次提高乙醇浓度进行反复处理，待乙醇浓度增加至95％时，将凝胶抽干。置60℃烘箱中烘干，可装瓶保存。在此过程中，溶胀的凝胶不能直接用高温烘烤，否则会粘结成块(机械捣碎会破坏珠状结构)。交联度越小的葡聚糖凝胶，越难以脱水。一般可采用将其较长时间浸泡在的60％-70％乙醇溶液中的作法来达到这一目的。*第69页，共102页，星期日，2025年，2月5日*第70页，共102页，星期日，2025年，2月5日核酸蛋白检测仪及记录仪（正面）*第71页，共102页，星期日，2025年，2月5日核酸蛋白检测仪及记录仪（背面）*第72页，共102页，星期日，2025年，2月5日二、基本原理凝胶过滤层析的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。这种物质可以完全，或者部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外。而对某些小分子化合物则不能排阻。但可让其在筛孔中自由地扩散、渗透。任何一种被分离的化合物在凝胶层析柱被排阻的范围均在0-100％之间。*第30页，共102页，星期日，2025年，2月5日其被排阻的程度可以用分配系数Kav(分离化合物在内水和外水体积中的比例关系)表示。Kav值的大小依赖于凝胶床的总体积(Vt)、外水体积(V。)以及分离物本身的洗脱体积(Ve)。即Kav=（Ve-Vo）/（Vt-Vo）在限定的层析条件下，Vt和Vo都为恒定值，而Ve则是随着分离物分子量的变化而变化的。分离物分子量大，Kav值小，反之则大。*第31页，共102页，星期日，2025年，2月5日*第32页，共102页，星期日，2025年，2月5日因此，在同一凝胶过滤柱上分离分子量不同的物质时，由于流动相的作用，这些分离物质将发生排阻和扩散效应。若缓冲液连续的倾入柱中，柱中物质的排阻和扩散效应也将连续的发生，其级终结果是分子量大的物质先从柱中流出，分子量小的物质则后从柱中流出，流出物用部分收集器分管等量或等时的收集起来，检测后分段合并相同组分的各管流出物，即等于把分于量不同的物质相互筛分开了。*第33页，共102页，星期日，2025年，2月5日影响筛分效果的因素：1）操作条件：如基质的颗粒大小、均匀度、筛孔直径和床体积的大小、洗脱液的流速以及样品的种类等；

2）Kav值的差异性。Kav值差异性大，分离效果好；Kav值差异性小，乃至等于1或等于零(即使样品个各组分的分子量相差很大)，则分离效果相差，或根本不能分开。*第34页，共102页，星期日，2025年，2月5日