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采用间接ELISA法测定抗血清效价的分析研究

采用间接ELISA法测定抗血清效价的分析研究

ELISA分析：采用间接ELISA法检测兔抗蚌热休克蛋白血清效价

实验步骤：

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包被：使用pH9.6、浓度为0.05mol/L的碳酸盐缓冲液，将纯化的重组热休克蛋白稀释至20μg/mL，并包被于酶标板上，每

孔加入100μL。将酶标板置于4℃条件下包被过夜。

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封闭：次日，向每孔加入100μL5%的脱脂奶粉，于37℃条件下封闭1小时。封闭完成后，使用pH7.4的PBST洗涤酶标板3

次。

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加样：向每孔加入200至51200倍稀释的兔抗血清100μL。阴性对照为150倍稀释的免疫前血清，空白对照为兔抗血清稀释

液（PBS）。每份样品均做1个平行样。将酶标板置于37℃条件下孵育1小时，然后同上洗涤3次。

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加酶标抗体：向每孔加入100μLHRP标记的羊抗兔IgG，于37℃条件下孵育1小时。孵育完成后，同上洗涤3次。

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显色：向每孔加入100μLTMB显色液，于37℃条件下避光反应20分钟。反应完成后，向每孔加入50μL2mol/L硫酸终止液。

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读数：在酶标仪上测定450nm波长下的OD值。

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ELISA分析结果：

根据间接ELISA法的判定标准，当（样品吸光值-空白吸光值）/（阴性吸光值-空白吸光值）2.1时，判定为阳性。经过计算，

本研究制备的兔抗血清效价为112800。

间接ELISA操作流程

一、实验准备

包被抗原：使用0.1mol/L的碳酸盐缓冲液将包被抗原稀释至工作浓度。

洗涤缓冲液：PBST（1×PBS+0.1%Tween20）。

封闭液：1.5%明胶或10%小牛血清溶于1×PBS中。

血清样品：按所需比例稀释。

酶标二抗：按说明书稀释于1×PBS中。

显色液：由OPD、H2O2和底物缓冲液组成。

终止液：2mol/LH2SO4。

二、操作步骤

.包被：

将稀释后的包被抗原每孔加100μL至酶标板中。

37℃孵育1小时后，放入4℃冰箱过夜。

弃去孔内液体，用PBST洗涤缓冲液洗涤3次，每次3分钟。

.封闭：

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每孔加200μL封闭液（选择1.5%明胶或10%小牛血清）。

37℃温箱放置1小时后，洗涤。

.加血清样品：

将血清样品按百倍比稀释后，每孔加入100μL。

37℃温箱放置1小时后，洗涤。

.加酶标二抗：

每孔加入11500稀释的HRP-羊抗鼠IgG（或按说明书稀释的酶标二抗）100μL。

37℃温箱放置1小时后，洗涤