DB45_T2311-2021_牛传染性鼻气管炎病毒的检测巢式聚合酶链反应法_广西壮族自治区 conv.docxVIP

ICS11.220

CCSB41 45

广 西 壮族 自 治区地 方标 准

DB45/T2311—2021

牛传染性鼻气管炎病毒的检测巢式聚合酶链反应法

DB45/T2311—2021

前

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则

起草。

言

第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

请注意本文件的某些内家可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由广西壮族自治区农业农村厅提出并宣贯。本文件由广西畜牧业标准化技术委员会归口。本文件起草单位：广西壮族自治区兽医研究所。本文件主要起草人：范晴、张民秀、王盛、李小凤、李丹、万丽军、阮志华、任红玉。

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牛传染性鼻气管炎病毒的检测 巢式聚合酶链反应法

1 范围

本文件规定了巢式聚合酶链反应法检测牛传染性鼻气管炎病毒的材料准备、操作方法及结果判定。本文件适用于广西行政区域内牛传染性鼻气管炎病毒的检测。

2 规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T31190 实验室废弃化学品收集技术规范

3 术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。3.1

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PCR：聚合酶链反应（polymerasechainreaction）

5 材料准备

5.1 IBRV特异性引物

引物序列见附录A中的A.1.1。外套引物F1和F2扩增的目的片段为416bp，内套引物F3和F4扩增的目的片段为334bp，引物使用浓度均为50pmol/μL，置于-20℃保存。

5.2 试剂

5.2.1 DNA抽提试剂

如下：

——TrizolDNA抽提试剂1)(或其它等效抽提剂)；——氯仿；

——异丙醇；——75％乙醇；

——100％乙醇；

——0.1mol/L柠檬酸钠乙醇；——8mmol/LNaOH。

5.2.2 PCR试剂盒

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5.2.5 试剂配置方法

见附录B。

5.3 仪器设备和一次性耗材

5.3.1 仪器设备

如下：

——PCR仪；——电泳仪；

——紫外检测仪；——凝胶成像系统；

——小型高速离心机；——旋涡振荡器；

——研钵或玻璃研磨器；——微量加样器；

——超净工作台。

5.3.2 一次性耗材

如下：

——手套；——离心管；

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供总DNA抽提。

6.2 待检样品总DNA抽提

在经预处理的250μL待检样品中加入Trizol?DNA抽提试剂750μL，混合均匀，室温作用10min，继续加入200μL氯仿，振荡混匀，室温放置15min，于4℃下7200g离心10min，弃上层液体，收集中间层和氯仿层液体，加入100％乙醇300μL，颠倒混合均匀，室温放置10min，于4℃下5000g离心10min，弃上清液，加入0.1mol/L柠檬酸钠乙醇1mL，室温放置30min，于4℃下5000g离心5min，再弃上清液，此步骤重复3次,加入75％乙醇2mL,室温作用10min,于4℃下5000g离心5min，弃上清液,将离心管倒置于超净工作台内风干10min,最后加入8mmol/LNaOH重悬总DNA100μL,抽提好的DNA置于-20℃保存。

6.3 NestedPCR检测

6.3.1 检测操作

6.3.1.1 外套PCR操作

在冰浴条件下，按如下用量分别加入各试剂：——10倍PCR缓冲液（含Mg2+），2.5μL；——5U/μLTaqDNA聚合酶，0.5μL；

——IBRV外套引物F1和F2(各50pmol/L），各1μL；——DNA，2μL；

——灭菌双蒸水，补足至总体积为25μL。

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d) 72℃延伸30s的循环，共循环35次，最后一次72℃延伸10min，结束扩增；e) PCR产物电泳或置于4℃保存。

6.3.2 NestedPCR空白对照及阳性对照

6.3.2.1 空白对照

用2μL灭菌双蒸水代替总DNA为模板作空白对照。

6.3.2.2 阳性对照

用含有IBRV结构蛋白gB基因的质粒2μL为模板作阳性对照。

6.4 电泳

6.4.1 将凝胶托架水平放置于工作台上，在卡槽内放上梳子。

6.4.2 称取1.0g琼脂糖于三角瓶中，加入1倍TAE电泳缓冲液100mL，微波炉加热溶解琼脂糖完全溶解至清亮无颗粒状，待凝胶液冷至50℃时，加入5