DB45_T2171-2020_甘蔗品种真实性鉴定SSR分子标记法_广西壮族自治区 conv.docxVIP

ICS 65.020.20

B05 DB45广西壮族自治区地方标准

DB45/T2171—2020

甘蔗品种真实性鉴定SSR分子标记法

SSR-basedmethodsforvarietygenuinenesstestingofsugarcane

DB45/T2171—2020

前

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则

起草。

言

第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

本文件由广西壮族自治区分析测试研究中心提出并宣贯。本文件由广西糖业标准化技术委员会归口。本文件起草单位：广西益谱检测技术有限公司、广西博测检测技术服务有限公司、广西吉锐安全技

术有限公司、广西壮族自治区分析测试研究中心。本文件主要起草人：梁俊、刘守廷、黄易勤、苏丽梅、杜寒春、黄小娟、刘巧频、何慧、梁群清、

莫璋红、韦秋翠、韦秀兰。

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甘蔗品种真实性鉴定SSR分子标记法

1 范围

本文件规定了利用简单重复序列（SSR）标记进行甘蔗品种真实性鉴定的操作程序、数据记录与统计、判定方法。

本文件适用于甘蔗品种SSR指纹数据采集及品种真实性鉴定。

2 规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求

3 术语和定义

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6 材料和试剂

除另有说明外，本文件中使用分析纯（含）以上试剂，用水符合GB/T6682规定的二级水，其中PCR用水要求达到一级水指标。

6.1 试剂

6.1.1 三羟甲基氨基甲烷（C4H11NO3）：纯度＞99%。6.1.2 乙二胺四乙酸二钠(EDTA·2Na)：纯度≥99.0%。6.1.3 硼酸（H3BO3）：ρ=1.43g/cm3，含量≥99.5%。

6.1.4 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）：ρ=1.32g/mL，纯度≥99.0%。6.1.5 氯化钠（NaCl）：ρ=2.165g/cm3，含量≥99.5%。

6.1.6 琼脂糖。

6.1.7 过硫酸铵（(NH4)2S2O8）：ρ=1.98g/cm3，含量≥98.0%。6.1.8 氢氧化钠(NaOH）：ρ=2.13g/cm3，含量≥96.0%。6.1.9 硝酸银（AgNO3）：ρ=4.35g/cm3，含量≥98.0%。6.1.10甲醛（HCHO）：ρ=0.815g/cm3。

6.1.11 液氮（N2）：ρ=0.81g/cm3。

6.1.12 三氯甲烷（CHCl3）：ρ=1.50g/cm3。

6.1.13 无水乙醇（CH3CH2OH）：ρ=0.79g/cm3，含量≥99.7%。6.1.14 DNA分析仪用LIZ500分子量内标。

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6.2.5 1%琼脂糖溶液

1g琼脂糖（6.1.6）溶于100mL的0.5×TBE缓冲液（6.2.2），适当加热融化。

6.2.6 10%过硫酸铵溶液

称取10g过硫酸铵（6.1.7），加入100mL纯水溶解。

6.2.7 电泳缓冲液

称取108g三羟甲基氨基甲烷（6.1.1）、7.44g乙二胺四乙酸二钠（6.1.2）、55g硼酸（6.1.3）、0.8g氢氧化钠（6.1.8），加入10L纯水溶解。

6.2.8 染色液

称取0.2g硝酸银（6.1.9），加入400mL纯水溶解。

6.2.9 显色液

称取4g氢氧化钠（6.1.8），加入400mL纯水溶解，临用时再加1.6mL甲醛（6.1.10）。

7 仪器和设备

7.1 电子天平：精确至0.1mg。7.2 恒温水浴锅。

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注：以上为推荐的DNA提取方法。其他能够达到PCR扩增质量要求的DNA提取方法也适用于本文件。

9.3 PCR扩增

9.3.1 PCR反应体系

PCR反应体系见表1。

表1 PCR反应体系

试剂

无菌纯水

2×TaqPlusPCR预混试剂10μmol/L正向引物10μmol/L反向引物25ng/μLDNA模板

总体积

终浓度 体积

-8.5μL1×12.5μL

0.4μmol/L 1.0