DB45_T2180-2020_甘蔗黄叶病毒检测技术规程_广西壮族自治区 conv.docxVIP

ICS 65.020.20

B16 DB45广西壮族自治区地方标准

DB45/T2180—2020

甘蔗黄叶病毒检测技术规程

Technicalcriterionfordetectionofsugarcaneyellowleafvirus

DB45/T2180—2020

前

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则

起草。

言

第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

本文件由广西壮族自治区糖业办公室提出并监督实施。本文件由广西糖业标准化技术委员会归口。本文件起草单位：广西壮族自治区农业科学院甘蔗研究所、广西甘蔗遗传改良重点实验室。本文件主要起草人员：魏春燕、覃振强、韦金菊、宋修鹏、张小秋、李德伟。

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甘蔗黄叶病毒检测技术规程

1 范围

本文件规定了甘蔗黄叶病毒检测技术规程的样品采集与存放，组织免疫印迹法检测和一步法RT-PCR检测的原理、仪器与设备、试剂、操作步骤和检测结果的判定。

本文件适用于甘蔗黄叶病毒的快速检测。

2 规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682—2008 分析实验室用水规格和试验方法

3 术语和定义

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5 组织免疫印迹法检测

5.1 原理

将待测的样品印迹在固相载体硝酸纤维素膜上，用病毒的特异性抗体与吸附在固相载体上的病毒进行特异性反应，再与碱式磷酸酶标记的第二抗体进行反应，最后用碱式磷酸酶的反应底物硝基酚磷酸片进行显色反应，根据颜色的变化，确定病毒的感染程度。

5.2 仪器与设备

5.2.1 圆周式摇床：可调振荡速度50rpm～300rpm。5.2.2 普通光学显微镜：放大倍数范围40X～1600X。5.2.3 电子天平：感量0.1g。

5.2.4 硝酸纤维膜、酒精灯、手术刀、载玻片、培养皿。

5.3 试剂

5.3.1 除另有规定外，所用试剂均为分析纯或生化试剂；实验室用水符合GB/T6682的二级水指标，其中涉及PCR的用水应符合一级水指标；所有试剂均用灭菌的容器分装，配制好的溶液均在4℃条件下保存。

5.3.2 甘蔗黄叶病毒单克隆抗体。5.3.3 碱性磷酸酯酶标二抗。

5.3.4 硝基酚磷酸片（BCIP/NBT）。

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5.4.2.2 第一次洗涤

用TBS-T缓冲液洗膜3次，每次5min，该过程在50rpm的水平摇床上进行，保证膜可以完全洗脱干净。

5.4.2.3 第一次孵育

将清洗后的膜转入含有1％脱脂奶粉的TBS-T缓冲液的培养皿中，同时在缓冲液中加入特异性抗体（抗体稀释比例为1:7000），在室温下孵育3h或4℃静置过夜，室温孵育时在转速为50rpm的水平摇床上进行。

5.4.2.4 第二次洗涤

同5.4.2.2。

5.4.2.5 第二次孵育

将清洗后的膜转入含有1％脱脂奶粉的TBS-T缓冲液的培养皿中，同时在缓冲液中加入含有碱式磷酸酶标记的二抗（抗体稀释比例为1:2000），在室温下孵育3h，孵育时在转速为50rpm的水平摇床上进行。

5.4.2.6 第三次洗涤

同5.4.2.2。

5.4.2.7 显色和终止

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6.1 原理

经反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。一步法RT-PCR中，反转录和PCR在同时为反转录和PCR的优化条件下，在同一支管中顺次进行。

6.2 仪器与设备

6.2.1 普通PCR仪。

6.2.2 电子天平：感量0.01g。

6.2.3 高速台式冰冻离心机：最大离心力15000g。6.2.4 组织研磨仪。

6.2.5水平电泳系统。6.2.6凝胶成像系统。

6.2.7 微量移液器：0.1μL～2.5μL，0.5μL～10μL，10μL～100μL，10μL～200μL，100μL～1000μL。6.2.8 无RNA酶的离心管、PCR反应管、硝酸纤维膜、手术刀、载玻片、酒精灯。

6.2.9 冰箱：2℃～4℃，-20℃，-80℃。

6.3 试剂

6.3.1 植物RNA提取试剂盒。6.3.2 一步法RT-PCR扩增试剂盒。

6.3.3 DNA分子量标准物（100bp～2000bp）。

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6.4.2 反转录及PCR反应

6.4.2.1 以样品、阴性和阳性对照总RNA为模板，并以超纯水为空白对照模板；选用一步法RT