第六章重组DNA技术.pptVIP

二、重组DNA技术的基本步骤3.目的基因与载体的酶切和连接1）限制酶同裂酶：来源不同，识别序列相同。切割方式有同识同切、同识异切GGATCCCCTAGGBamHⅠ与BstIGGTACCCCATGGGGTACCCCATGGKpnⅠAsp718Ⅰ第28页，共72页，星期日，2025年，2月5日二、重组DNA技术的基本步骤3.目的基因与载体的酶切和连接1）限制酶同尾酶：来源不同，识别序列不同，但形成的粘性末端相同。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAGGATCTA第29页，共72页，星期日，2025年，2月5日二、重组DNA技术的基本步骤3.目的基因与载体的酶切和连接2）连接酶催化两个DNA分子间磷酸二酯键的形成。DNA连接酶第30页，共72页，星期日，2025年，2月5日二、重组DNA技术的基本步骤3.目的基因与载体的酶切和连接2）连接酶第31页，共72页，星期日，2025年，2月5日二、重组DNA技术的基本步骤3.目的基因与载体的酶切和连接2）连接酶类型：大肠杆菌DNA连接酶：黏端连接效率高，平端连接效率极低。T4DNA连接酶：既可连接黏端，也可连接平端，但后者连接效率低很多。第32页，共72页，星期日，2025年，2月5日二、重组DNA技术的基本步骤3.目的基因与载体的酶切和连接3）连接方式之粘末端相连BamHIEcoRIBamHIEcoRIDNAligase第33页，共72页，星期日，2025年，2月5日二、重组DNA技术的基本步骤3.目的基因与载体的酶切和连接3）连接方式之粘末端相连EcoRIEcoRIEcoRIEcoRIDNAligase√第34页，共72页，星期日，2025年，2月5日二、重组DNA技术的基本步骤3.目的基因与载体的酶切和连接3）连接方式之平末端相连过程与单一酶切的两个片段的连接相同，但只能用T4DNAligase对于一个片段是粘末端，另一个片段是平末端的连接，先将粘末端进行末端修饰（用Klenow聚合酶或者T4DNA聚合酶平端化）后再行连接第35页，共72页，星期日，2025年，2月5日二、重组DNA技术的基本步骤3.目的基因与载体的酶切和连接4）连接条件温度与时间：16℃，12-16小时4℃，24-48小时片段与载体比例：粘末端约为3:1，平末端适当提高，可至10:1第36页，共72页，星期日，2025年，2月5日二、重组DNA技术的基本步骤4.重组DNA分子导入受体细胞1）受体对载体的复制和扩增没有严格的限制不存在特异的内切酶体系降解外源DNA重组缺陷型，不会产生体内重组容易导入重组DNA分子符合重组DNA操作的安全标准分原核受体、真核受体第37页，共72页，星期日，2025年，2月5日二、重组DNA技术的基本步骤4.重组DNA分子导入受体细胞2）导入方法之原核生物CaCl2法：Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙。电穿孔法：瞬时高压击穿细胞膜，形成微孔，外源DNA进入细胞。切断电场后，微孔可自行复原。第38页，共72页，星期日，2025年，2月5日二、重组DNA技术的基本步骤4.重组DNA分子导入受体细胞2）导入方法之真核生物酵母：醋酸锂法植物：农杆菌介导法动物：脂质体法、磷酸钙共沉淀法、显微注射法等第39页，共72页，星期日，2025年，2月5日二、重组DNA技术的基本步骤5.重组子的筛选与鉴定转化子就是掺入或导入外源DNA后获得了新的遗传标志的细菌细胞或其他受体细胞。阳性克隆子或目的重组子（positiveclone）：含有目的基因的重组子。第40页，共72页，星期日，2025年，2月5日二、重组DNA技术的基本步骤5.重组子的筛选与鉴定1)抗药性筛选:这是利用载体DNA分子上的抗药性选择标记进行的筛选方法。第41页，共72页，星期日，2025年，2月5日2)插入失活筛选法经过上述抗药性筛选获得的大量转化子中既包括需要的重组子，也含有不需要的非重组子。为了进一步筛选出重组子，可利用质粒载体的双抗药性进行再次筛选。二、重组DNA技术的基本步骤