抗微生物药物和敏感性试验.ppt

三、稀释法稀释法是把培养基内抗菌药物的含量按几何级数稀释并接种适量的细菌，经孵育后，观察能引起抑菌作用的抗菌药物浓度（即MIC），从而确定被检菌对某抗菌药物的最低敏感度。稀释法所获结果比较准确，常被用作校正其它方法的标准。但因操作繁杂，作为常规应用尚有一定的困难。第61页，共117页，星期日，2025年，2月5日分类：肉汤稀释法琼脂稀释法第62页，共117页，星期日，2025年，2月5日（一）肉汤稀释法有宏量稀释法和微量稀释法原理：以M-H液体培养基将抗菌药物做不同浓度稀释，然后接种待测菌，定量测定抗菌药物抑制或杀死该菌的最低抑菌浓度（MIC）或最低杀菌浓度(MBC)。第63页，共117页，星期日，2025年，2月5日MIC：抗菌药物能够抑制细菌生长所需要的最低浓度。单位：μg/ml或U/mlMBC：抗菌药物能够杀灭99.9%接种菌所需要的最低浓度第64页，共117页，星期日，2025年，2月5日1.培养基离子校正M-H肉汤（CAMHB）：Ca2+、Mg2+2.药物稀释（1）配制抗菌药物原液：?1000μg/ml重量（mg）=溶剂（ml）×浓度（μg/ml）/药物效价（μg/mg）体积（ml）=重量（mg）×药物效价（μg/mg）/浓度（μg/ml）稀释法第65页，共117页，星期日，2025年，2月5日3.菌液菌液的准备：0.5麦氏比浊标准（同纸片法）最终菌液浓度：5×105CFU/ml稀释法第66页，共117页，星期日，2025年，2月5日4.实验方法1）抗菌药物稀释：取试管10支，另取3支标记上“肉汤对照”、“测试菌生长对照”、“质控菌生长对照”。除第1管外每管加肉汤2ml，1、2号管加待测最高浓度药液（128μg/mg）2ml，依次对倍稀释至10管。2）测试菌的准备：0.5麦氏比浊标准，10倍稀释3）接种细菌：取0.1ml待测菌依次由低浓度到高浓度加到10支管中。4）孵育：35℃孵育16～18h稀释法第67页，共117页，星期日，2025年，2月5日第68页，共117页，星期日，2025年，2月5日结果判断：肉眼观察，含最小药物量仍呈明显不混浊的一管所含的抗菌药物浓度即为MIC。优点：稀释法所获结果比较准确，可靠，常被用作校正其它方法的标准，用于研究。缺点：劳动强度大，操作繁杂，作为常规应用尚有一定的困难。第69页，共117页，星期日，2025年，2月5日（二）琼脂稀释法原理将待测菌接种于含不同浓度的抗菌药物的琼脂平板上。经培养后观察菌落的生长情况，以能抑制细菌生长的最低药物浓度为该菌的最低抑菌浓度（MIC）。第70页，共117页，星期日，2025年，2月5日优点比液体稀释法重复性好每个平板同时可测定多株细菌可观察被检菌集落生长良好与否可发现污染菌落第71页，共117页，星期日，2025年，2月5日1.培养基：M-H琼脂2.含药琼脂的制备配制抗菌药物原液稀释抗菌药物加到融化MH琼脂中贮存日期：5天接种菌液的准备0.5麦氏标准，10倍稀释第72页，共117页，星期日，2025年，2月5日3.细菌接种（1）画格编号（2）点种待测菌：1～3μl/格直径5-8mm（104CFU/点）（3）培养18～24h观察结果第73页，共117页，星期日，2025年，2月5日4.结果判读先读质控平板的MIC，再读待检菌平板的MIC；在前后二个不同梯度浓度的抗生素M-H琼脂平板上，细菌生长数量由80%～90%突然减少为结果终点，即MIC值。结果报告：MIC（μg/ml）或敏感（S）、中介(I)、耐药(R)第74页，共117页，星期日，2025年，2月5日第75页，共117页，星期日，2025年，2月5日优点：①金标准，精确可靠。比液体稀释法重复性好。②每个平板可同时测定多株细菌。③可观察被检菌菌落生长是否良好。④可发现污染细菌。⑤可引入机械化手段，提高效率。缺点：测多个药时劳动强度大制备平皿费时费力。第76页，共117页，星期日，2025年，2月5日四、E-test法E试验(Epsilometertest)是一种对于微生物药敏试验直接定量的技术，它结合稀释法和扩散法原理、特点，克服了上述二种方法缺点，能直接定量出药