第三节细胞的传代培养技术08课件.pptx

第三节

细胞的传代培养技术;细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。

传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。;1．将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。

2．加入0.5—1ml0.25％胰蛋白酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液

中。

3．放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐

趋于圆形，在还未漂起时将胰蛋白酶弃去，加入10ml培养液终

止消化（观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针

孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为1—3分钟）。

4．用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，置

37℃下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。;第四节

细胞计数技术;培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。

在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。

用台盼兰染细胞，死细胞着色，活细胞不着色，从而可以区分死细胞与活细胞。利用细胞内某些酶与特定的试剂发生显色反应，也可测定细胞相对数和相对活力。;①准备计数板：取血细胞计数板和盖玻片，用70%洒精擦净。

②制备细胞悬液：用消化液分散单层培养细胞或直接收集悬浮培养

细胞，制成单个细胞悬液。

③加样：用吸管轻轻吹打细胞悬液，取少许细胞悬液，在计数板上

盖玻片的一侧加微量细胞悬液。

④计数：在显微镜下，用10倍物镜观察计数板四角大方格中的细胞

数。

⑤计算：将计算结果代入下式，得出细胞密度。

细胞数/每毫升=（4大格细胞数之和/4）?104?稀释倍数;血细胞计数板;注意事项：

①消化单层细胞时，务求细胞分散良好，制成??个细胞悬液。否则会影响细胞计数结果。

②取样计数前，应充分混匀细胞悬液。在连续取样计数时尤应注意这一点。否则，前后计数结果会有很大误差。

③镜下计数时，遇见2个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计数。如细胞团占10%以上，说明消化不充分。

④细胞数少于20个/1mm2或多于50个/1mm2时，说明稀释不当，需重新制备细胞悬液。

⑤在计数板上盖玻片的一侧加微量细胞悬液时，加液量不要溢出盖片，也不要过少或带气泡。

⑥在计数过程中，对大方格的边缘压线细胞应按数上不数下，数左不数右的原则进行计数。;第五节

细胞冻存与复苏技术;在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在－130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。

细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的－5～0℃，细胞仍能生长，活力受损不大。

目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。;1．冻存

①消化细胞（同实验二），将细胞悬液收集至离心管中。

②1000rpm离心10分钟，弃上清液。

③沉淀加含保护液的培养，计数，调整至5×106/ml左右。

④将悬液分至冻存管中，每管1ml。

⑤将冻存管口封严。如用安瓿瓶则火焰封口，封口一定要严，否则

复苏时易出现爆裂。

⑥贴上标签，写明细胞种类，冻存日期。冻存管外拴一金属重物和

一细绳。

⑦按下列顺序降温：室温→4℃（20分钟〕→冰箱冷冻室（30分钟）

→低温冰箱（－30℃1小时）→气态氮（30分钟）→液氮。;2．细胞的复苏

①将冻存于液氮中的冻存管取出（取出时应戴好手套和防护眼镜），迅速放入37-40℃水浴中使其在1min内融化。

②无菌操作下打开冻存管，将细胞悬液吸取到培养瓶中，补足生长液后，置37℃培养。待细胞贴壁（约4h）后，换培养液一次。

③或取出细胞悬液至离心管中，补加10ml培养液，500-1000r/min低速离心5min，去上清，用培养液适当稀释后装入培养瓶中，置37℃培养，次日后更换一次培养液。

④待细胞长成单层后即可传代。