动物转基因和生物反应器综合课件第6章基因的整合.PPTVIP

许多真核基因的启动子含有TATA框，它位于基因转录起始位点上游约30个碱基之处，共有序列为TATA（A/T）A（A/T）。TATA框的主要功能是决定从哪一个碱基开始基因的转录。Inr序列。Inr序列的位置不是在转录起始位点的上游，而是围绕在转录起始碱基（通常为腺苷酸）的两侧，其共同序列为Y2AN(T/A)Y2。TBP、RNA聚合酶Ⅱ及其它相关的转录因子所构成的基因转录复合体，只能启动基础水平的转录活动。另有一类基因的启动子既不含有TATA框，也不含Inr序列。这类基因中许多都是执行基本生理功能的“管家基因”，其转录启动过程还不是很清楚，但似乎含有另外一类启动序列。2．其它短的调控序列在TATA框的上游，还存在另外一类调控序列，按它们的功能区分主要可以分成两类。一类序列是通过结合其它转录激活因子，提高转录水平。另一类序列只存在于特定基因启动子上游，它们只对特定信号起反应。对基因起调控作用的短DNA序列基元有许多种，它们一般都处在TATA框（如果存在的话）的上游不远之处，对基因转录起着活化作用。这类序列调控基因表达的机制有两种：一种方式是通过结合蛋白因子使一个核小体被置换，给转录因子与TATA框的结合创造了一个通道；另一种方式也可能是增加转录复合体的稳定性或活性，从而提高基因转录水平。就某一个具体基因讲，可能不止存在一种转录调控序列，因而，基因转录的调控是多种因子共同作用的结果。3．增强子真核基因的表达除了受位于转录起始位点附近的DNA序列的调控外，还要受到距离很远的一类调控序列的调控。这类序列叫做增强子，其本身不具有启动子的功能，但能够使启动子的转录活性提高数百倍。增强子的作用方式有以下三个重要特点：(1)远距离操纵。当把一个增强子放到距离启动子几千个碱基的地方时，它仍然可以激活启动子；(2)双向作用。当把一个增强子与一个启动子连结在一起的时候，无论采取5’—3’的方向连结，还是采取3’—5’的方向连结，均不影响增强子的功能；(3)无位置效应。无论把增强子置于基因转录区的上游、下游或是内含子中，都不影响增强子的功能。许多组织特异性表达的基因也含有增强子，这类增强子的活性通常也表现组织特异性，只能在特定组织中增强其它启动子的活性。因此，基因的组织特异性表达的特性，是启动子近端调控序列和行使远距离调控的增强子共同作用的结果。4．基因座控制区基因座控制区是调控基因正确表达的另一种重要元件。基因座控制区的作用机制是通过改变其相邻基因的染色质结构，导致这些基因被转录。在构建转基因表达结构时，若将基因座位控制区包括在内，将会使目的基因在转基因动物中实现不依赖整合位点的、组织特异性的和高效的表达。相反，没有基因座位控制区，被转移的基因将会受到邻近的基因调控元件的影响，产生位置效应，也许表达，也许不能表达。5．核基质附着区（MAR）MAR序列的基本功能是将染色质的环状域附着到称为核基质的蛋白质支架上，构成基因组中各个功能域的边界，相当于基因组中的“标点符号”。在以MAR为边界的一个染色体环状域中，基因座控制区和增强子等调控元件，只能在本域内发挥作用。相邻环状域的调控元件，也不能越过这个边界，影响另一个域内基因的表达特性。MAR序列的功能没有组织特异性。二、表达结构的构建和功能域转移由于多数基因的基因座控制区和远端增强子尚未分离出来，在构建用于生产转基因动物的表达结构时，一般都是在目的基因的两端各增加一个1—5kb的DNA片段，大概只含有启动子、增强子和多聚腺苷酸化信号。当这样一种结构整合到动物染色体上之后，目的基因的表达完全要依赖整合部位的染色体环境。若要可靠和有效表达目的基因，必须构建和转移完整的功能域，使被转移的基因表达结构包含一切必要的调控元件，以便实现不依赖整合位点的有效表达。在缺乏LCR调控元件的情况下，一种行之有效的方法是利用大片段DNA，如酵母人工染色体，作为基因表达的载体。*DNase法鉴定的片段一般为40bp，为了得到准确的结果，一般采用足迹法（footprinting）*间距非常重要，17bp的间距转录效率最高（开放型启动子复合物形成时,DNA模板链的解链长度12~17bp）动物组织的多样性，是由基因的组织特异性表达造成的，这一点早已被证实。组织特异性基因表达是通过两种调控机制实现的。第一种调控过程是相对短效的调控过程，由出现在表达细胞内的调控因子结合到基因的调控DNA序列上，激活基因表达。第二种调控过程是长效调控。这种调控过程使细胞永久性地处于分化状态，每一种细胞都可以长期维持和记忆它所属的细胞类型的特征，只表达它应当表达的基因。DNA分子在细胞中不是处于伸展状态，而是和特殊的核蛋白一起折叠和紧缩为一种称为染色质的