动物转基因和生物反应器 第6章动物转基因方法.pptVIP

第六章

动物转基因方法;前言：向动物体转移外源基因的目的，是使转基因动物的所有细胞(包括体细胞和性细胞)都带有被转移的外源基因。

到目前为止，所有的动物转基因方法，均涉及对单细胞受精卵或者受精之前的配子进行操作。;主要步骤;第一节目的基因制备和载体系统;第一节目的基因制备和载体系统;

目的基因来源：基因组DNA分离、化学合成、PCR扩增、cDNA文库及DNA文库中制得。

载体：质粒、λ噬菌体、柯氏质粒、YAC载体等;

工具酶：限制性内切酶、连接酶、DNA聚合酶等;PCR反应;;利用cDNA法;cDNA链的合成;质粒载体;质粒载体pBR322;pUC19质粒;λ噬菌体;λ噬菌体载体;柯氏质粒Cosmid;

;;*;*;*;*;/programs/view/cOuKlFXMRlw

/v_show/id_XOTUxMjI2MjQ=.html?from=y1.2-1-176.4.9-1.1-1-2-8

;DNA显微注射;（1）硅烷油注入：取培养皿或表玻皿，注入已经过平衡处理过的液体硅烷油或石蜡

（厚约5mm）；

（2）加培养基：通过硅烷油或石蜡层向培养皿底接种培养液，以100?l为单元的小滴

数个，各滴间相距1一2cm(视小滴多少而定)；

（3）胚卵接种：吸取待受注射胚卵数个，通过油层分别接种入培养液小滴中；

（4）DNA准备：从Eppendorf管中取一份DNA后；用75%乙醇漂洗后，真空中干燥，

重悬于注射缓冲液中(含1mgDNA／ml)，使其最终浓度为：0.05~0.5mg/ml；

（5）于临注射前把DNA样品在Eppendorf管中再离心一次(1200rpm，10分钟)，以消

除末溶解物，防止阻塞注射管口；

（6）把待注射用的DNA装入注射管中；;（7）在显微镜下把支持吸管转移到培养液小滴中，选一健康胚卵；先吸少量培养液，仅令充入吸管末端，然后吹出；在吸管保持负压状态下吸住胚卵，继之把支持管调至皿底令胚卵靠于皿底面中央部；

（8）调注射针至胚卵近处，先调显微镜焦点看清针尖，然后通过透明带刺入胚卵细胞膜内(小鼠胚卵直径约10?m)，进而继续进针再刺入任一原核内（雄性原核多位于周边部，体积较大，为主要注射对象）。注射针刺入细胞内进行注射时，如细胞核微微发生膨胀，证明DNA已被注入，反之需重新进行注射；注射细胞数量越多越好；

（9）用支持吸管把已注射细胞移入另一培养小滴中，使之与未注射细胞分开；待注射结束后，把所有细胞均移入培养液中，置入温箱培养30分种；

（10）镜下观察细胞，发现有溶解死亡崩溃者弃掉。;;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;用显微注射的方法生产转基因动物，是一项综合技术，至少涉及以下四个主要步骤：

(1)构建外源基因表达载体并生产用于注射的DNA溶液；

(2)准备供注射用的胚胎并制订显现原核的技术方案；

(3)实施显微注射并将注射后的胚胎进行相应的技术处理，然后移植到受体母畜中；

(4)对出生的幼畜进行基因整合和表达的检测，把筛选出来的转基因动物繁殖传代培养，进而建立转基因动物的家系和群体。

;*;显微注射法的优点;缺点;（二）反转录病毒载体法

;*;*;逆转录病毒载体

虽然理论上所有逆转录病毒均可以用来制作转基因载体，但小鼠白血病毒是首选的研究对象，因为它的寄主范围是哺乳类，用它制作载体系统，既可以用于动物转基因，也可以用于人类基因治疗。;一、反转录病毒载体;2.反转录病毒的基因组结构;（1）删除pol、env和gag基因。;反转录病毒DNA转化细胞的效率很低，必须包装成病毒颗粒转染细胞。;5’LTR;①用载体DNA转化包装细胞系;

当它粘附细胞并将其RNA注入宿主细胞内之后，病毒RNA即被逆转录为DNA并整合到细胞的基因组中。这种整合是有序的和稳定的，整合的拷贝数和位点相对固定，有别于裸露DNA的随机整合。

最重要的是，病毒复制所需要的RNA（DNA）序列可以严格的区分为顺式元件和反式元件两类，且这两类元件可以分开。这一特点便于将它改造成不能自我复制的重组病毒，用作基因转移载体。与此同时，可以创造一种受体细胞，用来生产必须的病毒蛋白质，恢复重组病毒的侵染性。

;;

研制逆转录病毒载体的基本原则，是去掉反式序列而保留所有的顺式序列。这样的载体具有逆转录病毒基因组的全部功能，但不能生产包装蛋白，其自身不能成为侵染细胞的病毒粒子。

逆转录病毒载体转染胚胎是最早使用的生产转基因动物的方法。但是，经过许多年的努力仍然没有人用逆转录病毒载体生产出一头转基因动物。;1998年，Bremel领导的研究组在PNAS上发表研究报道，证明将逆转录病毒载体注射到中期Ⅱ卵母细胞的卵周间隙中，可以生产高比例的转基因动物，他们的