动物转基因和生物反应器 第11章基因定向转移技术.pptVIP

第十一章定向基因转移技术Targetedgenetransfertechnology

定向基因转移：精确地人工修饰基因组的一种技术。特点：1、直接性。2、准确性。3、有效性

基因敲除(knockout)：一种遗传工程技术，针对某个序列已知但功能未知的序列，改变生物的遗传基因，令特定的基因功能丧失作用，从而使部分功能被屏障，并可进一步对生物体造成影响，进而推测出该基因的生物学功能。基因定点突变：是指按照设计的要求，使基因的特定序列发生插入、删除、置换和重排等变异。

体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间关系的有力工具。蛋白质的结构决定其功能，对某个已知基因的特定碱基进行定点改变，可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构和功能，改造酶的不同活性或者动力学特性。

一、Cre/Loxp系统

Cre：由P1噬菌体编码的约38KD的重组酶，Cre重组酶有70%的重组效率，不借助任何辅助因子。可作用于多种结构的DNA底物，如线形、环状甚至超螺旋DNA。是一种位点特异性重组酶，能识别特异的DNA序列。可以特异性的识别并催化34个碱基重复序列，即loxP位点。

LoxP（locusofX-overP1）序列：来源于P1噬菌体，是有两个13bp反向重复序列和中间间隔的8bp序列共同组成，8bp的间隔序列同时也确定了LoxP的方向。Cre在催化DNA链交换过程中与DNA共价结合，13bp的反向重复序列是Cre酶的结合域。其序列如下：

Cre-LoxP系统的特性Cre重组酶介导两个LoxP位点间的重组是一个动态、可逆的过程，可以分成三种情况：1、如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，且方向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列；2、如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，但方向相反，Cre重组酶能导致两个LoxP位点间的序列倒位；3、如果两个LoxP位点分别位于两条不同的DNA链或染色体上，Cre酶能介导两条DNA链的交换或染色体易位。

两个loxp位点的方向相反CreloxploxpGeneGenepromoterpromoterloxploxp

应用1、去除筛选标记2、创造大片段缺失3、基因重置

打靶载体的构建

将打靶载体导入宿主细胞

阳性克隆的筛选

品系纯化

转基因动物的维持DukeUniversityLaboratoryAnimalResourcesCenter

表1.用基因打靶法制备的一系列重要的基因敲除小鼠及表型：敲除基因表现型RAG-1和/或RAG-2因无TcR基因重排而无T细胞TcRβ双阴性胸腺细胞聚集，双阳性胸腺细胞很少，TcRα正常重排TcRα有双阴和双阳T细胞而无单阳性T细胞P56lckT细胞发育在早期双阳性成熟期受阻，无?δT细胞CD3-ζT细胞发育在早期双阳性成熟期受阻CD45T细胞发育在双阳性成熟期受阻MHC-Ⅱ,不变链无CD4+T细胞，CD4+CD8-/+很少，正常NK，1.1+CD4+,CD8+正常CD4CD8+数量和功能正常MHC-Ⅰ，β－2微球蛋白无CD8+T细胞，CD4+T细胞正常TAP1/TAP2TcR-δ无?δT细胞，对结核杆菌易感性增加P59fynT细胞发育正常，T细胞应答缺损IgM穿膜区