mrna测序文库构建流程中文版.pdfVIP

第一章mRNA纯化及片段化（PurifythemRNAandFragmentation）3

第二章c第一链合成（SynthesizetheFirstStrandc）5

第三章c第二链合成（SynthesizetheSecondStrandc）6

第四章末端修复（PerformEndRepair）7

第五章3末端加腺苷酸（Adenylate3Ends）8

第六章连接接头（LigatetheAdapters）9

第七章富集纯化的c模板（EnrichthecTemplates）11

第八章文库质检（QCthelibraries）13

第九章簇生成(ClusterGeneration)14

第十章上机（Sequencing）15

第十一章试剂和仪器（ReagentandEquipment）16

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第一章mRNA纯化及片段化（PurifythemRNAand

Fragmentation）

1.实验前注意事项

A、建议使用6-10μg纯化前的totalRNA用于纯化mRNA。

B、磁珠纯化用的AMPureXPBeads需要提前放置室温平衡30min。

C、AMPureXPBeads纯化时，加入洗涤磁珠需在磁力架上进行，

勿打散磁珠。

D、磁珠纯化吸去上清液时，勿将磁珠带出。

E、AMPureXPBeads纯化时所需的80%EtOH现用现配。

2.在1.5mlRNase-free离心管中加入3g纯化后的总RNA。用RNase-free

水调节体积至50μL。

3.充分震荡混匀RNAPurificationBeads。

4.加入50μL已混匀的RNAPurificationBeads到含有RNA的1.5mlEP管

中。用移液器轻轻吹打数次，直到混匀为止。

5.65°C金属浴中孵育样品5min。

6.从金属浴中取出样品，室温放置5min。

7.将含有磁珠与RNA的1.5mlEP管放置在磁力架上，等待5min，使磁

珠与磁力架充分吸附。

8.待上清液澄清后，弃上清液，将含有mRNA-Beads的1.5mlEP管从磁

力架拿起，加入200μLBeadWashingBuffer，充分混匀。然后再放置在

磁力架上吸附，等待5min。

9.弃掉上清液，在加入50μLElutionBuffer，充分混匀。

10.混匀后，80°C金属浴中孵育样品2min，使mRNA从磁珠上洗脱。

11.待样品冷却至室温，再加入50μL的BeadBindingBuffer至含有

mRNA-Beads的1.5mL的EP管中，充分混匀后室温放置5min。

12.将重新结合的EP管放置在磁力架上吸附5min，使含有mRNA的磁珠

充分吸附到磁力架一边，与上清分离。

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13.待上清液澄清，弃上清液，将含有mRNA-Beads的EP管从磁力架

上取下，加入200μLBeadWashingBuffer，充分混匀，然后再放置