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胰岛素的折叠
张蓉
摘要
本文主要研究了人胰岛素原的体外折叠途径,在HPI的折叠过程中分离到四个主要的中间体P1,P2,P3和P4。对四个中间体的结分析发现它们都是三个二硫键保持完整的二硫键异构体,其中P1含有两个非天然的链间二硫键,P2含有一个天然的A20-B19二硫键,P3含有B7-A20二硫键,P4含有B7-B19二硫键。其次,本文也阐述了C肽以及二硫键异构体在HPI折叠中的作用。
关键词:人胰岛素原(HPI)二硫键异构体折叠起始点
C肽
通过晶体衍射【1】和NMR【2】对胰岛素的三维结构进行深入研究发现,它的三级结构示意图如图1a所示。A链含有两个通过转角A9Ser-A12Ser相连的反平行的a螺旋(A2Ile-A8Thr和A13Leu-A19Tyr,分别称为helix2和helix3),B链的中部含有一个a螺旋(B9Ser-B19Cys,称为helix1)。当胰岛素形成二聚体时,两个分子的B链羧基端B23-B28形成一个反平行的β片。B链的羧基端与A链的氨基端在空间结构上紧密相邻。胰岛素分子中的三个二硫键对于稳定天然的构象非常重要。A6-A11包埋在分子的内部,靠近疏水核心,它被Ala或Ser取代后会导致helix2的破坏【3】;A7-B7完全暴露在分子的表面,它的缺失能够破坏A链上的helix2和部分helix3,从而导致整体构象比较松散;A20-B19则
一部分靠近疏水核心,另一部分暴露在分子的表面,它是三个二硫键中最重要的一个,缺失了A20-B19的PIP突变体不能正确折叠致使在酵母表达体系中不能被分泌4表达【4】。
对于一个含有二硫键的单结构域蛋白来说,稳定蛋白质的构象或驱使蛋白质折叠的作用力有两种,一是非共价相互作用,包括范德华力,疏水相互作用,盐健等,二是二硫键的共价交联【5】。两种作用力相互协调,共同来启动、指导蛋白质的折叠和维持它的高级结构。HPI氧化折叠的过程就是这两种作用力交互支配蛋白质折叠的一个过程。
Helix
Helix1
(a)7
NH24Helix2
A11
A-chals
A20
819
Hellx3
B-chain
(b)
图1.(a)胰岛素的三级结构示意图。α螺旋用柱形表示,β片用带有箭头的长方形表示。图中标明了三个二硫键的相对位置,虚线表示C-S键的位置朝向分子内部,实线表示C-S键朝向分子的表面。硫原子用实心的黑点表示。(b)人胰岛素原(HPI)的氨基酸序列示意图。氨基酸用单字母的简写表示。残基在肽链上位置参照胰岛素的命名方法。箭头指示V8蛋白酶的作用位点,其中一个空心箭头表示V8蛋白酶在NH4HCO3溶液中一个不专一的酶切位点。在二硫键
打开的情况下用V8酶切后一共有9个肽段,自氨基端至羧基端依次命名为F1-F9。
HPI在体外折叠时一个较为详细的折叠途径的分子机制。
1)在氧化折叠的初期,还原的HPI在氧化试剂的作用下,自由巯基随机碰撞形成分子内的三个完整二硫键,从而形成不均一的二硫键异构体(scrambleddisulfideisomers)中间体,在这些异构体中大部分是非天然的二硫键(P1,P2,P3,P4中均含有至少两个非天然二硫键)。在这个过程中,二硫键的形成顺序没有一定的规律,因为这时二级结构和高级结构还没有最后形成,frdHPI中的非共价相互作用不占主导地位,不能指导二硫键的
配对。2)随后,这些二硫键异构体中的非共价相互作用开始逐步发挥作用并支配二硫键的重排,促使非天然的二硫键向天然二硫键的转变。在这个过程中,主要有以下步骤:a)在P4的再折叠过程中,B链中helix1的形成促使B7-B19的断裂并导致两个链间二硫键的形成。两个链间二硫键的一个重要作用是把B链的折叠信息很快地传递到A链,促使A链内部helix2和helix3的形成。b)P4中B链内部二硫键的断裂后如果形成了A20-B19(如形成了P2),在A20-B19的牵引下,B7与A链上相距较近的三个Cys(A6,A7,Al1)的距离靠近,可以更为容易地形成二硫键;其中天然二硫键B7-A7形
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