RNA干扰及其应用(共49张PPT).pptx

RNA干扰及其应用;RNAi的发现;RNAi的提出;RNAi广泛存在于自然界;1、RNAi机制;体外实验结果的提示;RNAi作用的简单模型;RNAi研究的一般技术路线;;何为siRNAs;一般设计原则;FAs存在于细胞表面，它能够启动细胞的自杀程序。

Tuschl等建议不要针对5和3端的非编码区（untranslatedregions，UTRs）。

不适用于：筛选siRNA等长时间的研究，主要原因是价格因素

通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。

（4）siRNA表达载体

由于价格比其他方法高，为一个基因合成3—4对siRNAs的成本就更高了，比较常见的做法是用其他方法筛选出最有效的序列再进行化学合成。

Mett等证明含有启动子区的dsRNA在植物体内同样被切割成21-23核苷酸长的片段，这种dsRNA可使内源相应的DNA序列甲基化，从而使启动子失去功能，使其下游基因沉默。

多数的siRNA表达载体依赖3种RNA聚合酶III启动子(polIII)中的一种，操纵一段小的发夹siRNA在哺乳动物细胞中的表达。

针对HIV病毒研究有Jacque等设计的抑制HIV1长末端重复序列、附件基因vif和nef表达的siRNA，Lee等针对rev转录子设计的siRNA及Novina等]针对HIV病毒gag基因设计的siRNA，其基本策略都是选择HIV病毒或宿主细胞基因为靶点。;3、制备siRNAs的方法;（1）化学合成;（2）体外转录;;（3）用RNaseIII消化长片断双链RNA制备siRNA;（3）用RNaseIII消化长片断双链RNA制备siRNA;（4）siRNA表达载体;（4）siRNA表达载体;;（5）siRNA表达框架;（5）siRNA表达框架;;制备siRNA5种不同方法的比较;制备siRNA5种不同方法的比较（续）;4.转染细胞;5.RNAi的效果分析;;（1）在功能基因组中的应用;编码区RNAi技术;编码区RNAi技术;编码区RNAi技术;启动子区RNAi技术;（2）在基因治疗中的应用;治疗HIV感染;治疗肝炎病毒感染;细胞的代谢过程，生理生化系数等表型参数的变化是RNAi效果最终和最大的体现。

由于价格比其他方法高，为一个基因合成3—4对siRNAs的成本就更高了，比较常见的做法是用其他方法筛选出最有效的序列再进行化学合成。

识别之后，mRNA与dsRNA的有义链发生链互换，原先dsRNA中的有义链被mRNA代替，从酶-dsRNA复合物中释放出来，而mRNA则处于原先的有义链的位置。

最适用于：已经找到最有效的siRNA的情况下，需要大量siRNA进行研究；

（1）从mRNA的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。

热激处理后，反向重复序列在细胞内开始转录，其产物会形成具发夹环结构的dsRNA，从而产生RNAi，使目的基因沉默。

如何设计有效的siRNA一直是当前RNAi研究的热点话题，不同的实验室有不同的结果。

这样在转基因个体内转录出的RNA可形成dsRNA，产生RNA干涉，使目的基因沉默，从而进一步研究目的基因的功能，这种技术即为RNAi技术。

VariableReductioninTargetGeneExpressionUsingSECswithDifferentPromoters.

HeLacellsexpressingcycle3GFPweretransfectedwithhygrocontaininganinsertencodingansiRNAtargetingcycle3GFPorpSilencer2.

体外实验表明：RNAi反应中，加入的dsRNA被切割为21-23核苷酸长的RNA片段，后者会使目的mRNA被切割为21-23核苷酸长的片段。

（1）从mRNA的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。

Green:GFP.;治疗肿瘤;体内小RNA作用的重新认识;1）抗病毒功能;2）基因调控;3）染色质浓缩;其次dsRNA可以被诱导产生，RNAi能够在发育特定阶段出现，从而使研究发育早期必需基因在发育晚期的功能成为可能；

最适用于：筛选siRNAs，特别是需要制备多种siRNAs，化学合成的价格成为障碍时。

mRNA：RT-PCR；

1995年，GuoS等试图阻断秀丽新小杆线虫（C.

2、siRNA的设计

裂殖酵母中内源siRNA可介导中心粒区染色质浓缩，导致这个位点的基因转录沉默。

使用这类载体，需要2段编码短发夹RN