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脐带间充质干细胞分离培养操作细则

一、样本接收

1.观察运输箱的温度是否符合要求，采集瓶有无渗漏。

2.查看客户信息是否与交接表一致。

3.样本采集瓶外表面喷酒精擦拭消毒，并粘贴样本编码，填写样本接收记录，

传入洁净区准备制备。

二、脐带间充质干细胞分离与接种

1）准备耗材试剂：10cm培养皿、15ml离心管、50ml离心管、离心管架、10ml

移液管、T75培养瓶、离心管架、无尘布、50ml注射器针头、封口膜、灭菌止血钳、

灭菌镊子、灭菌剪刀、废液缸、无血清干细胞培养基（常温复温）、生理盐水、75%

酒精（已过滤）。

2）仪器设备准备及预热：电动移液枪、生物安全柜、离心机

3）将75%酒精喷到台面，用无尘布擦拭台面，包括侧面及玻璃。

4）将生物安全柜开紫外30min通风10min，样本喷酒精擦拭，放入生物安全柜

中，电动移液枪、移液管、离心管、离心管架喷酒精擦拭放入生物安全柜中，无菌

棉球放入到广口瓶中加75%酒精放入生物安全柜中。50ml、15ml离心管放到离心管

架上，10cm皿5-7个。将装有灭菌器械的灭菌盒喷酒精擦拭放入生物安全柜中。

5）取5个10cm皿依次摆开，1，2，4，5号皿依次加入适量的生理盐水，3号

皿加入适量的已过滤的75%酒精。拿出灭菌盒中已灭菌的止血钳，将脐带从保存瓶

中取出放到第一个皿里，并取适量样本保存液留样送检支原体。使用两个止血钳将

脐带在第一个皿里清洗尽量去除脐带外表面的血污以及动静脉的血液和血凝块，将

脐带转移至2号皿中，同样的方法再次清洗一次并测量其长度。

6）将清洗干净的脐带转移到装有已过滤75%酒精的3号皿中浸泡1min左右（不

要超过两分钟），计时结束后，将脐带转移至4号皿中，同样的洗涤方法去除酒精。

清洗结束后将脐带剪成1-2cm短节，放入5号皿中，再次洗涤尽量去除血管内的血

污。再次拿两个10cm皿，加入适量的生理盐水，去一皿的盖子加少许盐水湿润底部

及可。

7）将1-2cm的脐带小段转移到新的皿里，用带齿口的镊子取一段脐带，将脐带

展开，再按血管走势剔除脐带的两条动脉，一条静脉。用组织镊将华通氏胶撕下，

并放入到新的加有生理盐水的培养皿中。

8）待所有脐带撕完结束后，将华通氏胶在原皿中洗涤一次，并将其转移至50ml

离心管中，使用剪刀将其在离心管中剪碎，直至将胶体剪成1-4mm3组织匀浆块，

加生理盐水定容（此时可观察组织块是否符合大小要求，若不符合可离心结束后在

继续剪），放入离心机离心800-900g,5min，收集末次洗涤的上清，送检需氧厌氧真

菌。

9）根据末次离心结束后的胶体体积，计算所需接种瓶数（0.5-0.6ml/T75）。可

先将空T75瓶加入10ml无血清干细胞培养基，再用去头10ml移液管吸取华通氏胶，

在每个T75培养瓶中加入0.5-0.6ml组织块。并在培养瓶上记录好操作信息。

10）晃动培养瓶将组织块均匀分布于整个底面，并在培养瓶上记录好操作信息，

平置放入37℃5%的二氧化碳培养箱中培养。

11）清场，将安全柜中的试剂耗材喷酒精擦拭并拿出，按其储存条件放回对应的

环境中，培养基放到4℃冰箱中避光，移液管放回推车上。拉下玻璃窗，开紫外定时

30min。收垃圾，更换垃圾袋。将收集的垃圾打包到医疗垃圾暂存库。

三、脐带间充质干细胞培养

1）准备耗材试剂：50ml离心管、离心管架、10ml移液管、无尘布、废液缸、

无血清干细胞培养基（常温复温或水浴复温）、75%酒精。

2）仪器设备准备及预热：电动移液枪、生物安全柜、倒置显微镜、水浴锅。

3）将生物安全柜开紫外30min通风10min，无血清干细胞培养基、电动移液枪、

移液管、离心管、离心管架喷酒精擦拭放入生物安全柜中。

4）培养5-6天，开始第一次换液，培养基倒入离心管中进行换液（防止将原瓶

培养基污染）。把培养瓶平稳从37℃5%的二氧化碳培养箱中拿出放入到安全柜中，

吸取培养瓶中培养基并收集离心弃10ml旧培养基，加入10ml新鲜完全培养基重悬，

加入到T75瓶中，培养瓶倾斜角度不要大于15°也不能冲洗培养瓶底部。可在倒置

显微镜下观察是否有细胞爬出。将培养瓶平稳平置放入37℃5%的二氧化碳培养箱

中培养。