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凝胶过滤法分离蛋白质

实验原理

ONE:

分子筛层析molecular-sievechromatography

凝胶过滤层析gel-filtration?chromatography

分子排阻层析molecularexclusionchromatography

凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物质却被排除在外部。当混合溶液过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质按不同分子量筛分开。

TWO:凝胶过滤介质

不溶于水，在水中有较大膨胀度和较好的分子筛功能，多孔的网状结构。

常用凝胶：葡聚糖凝胶（Sephadex）和琼脂糖凝胶（Sepharose），聚丙烯酰胺凝胶（Bio-gelP）。

凝胶因交联度不同,孔径不同，交联度越大，孔径越小。

蛋白质分子直径凝胶孔径时，被排阻在外，小于孔径者则进入凝胶。

THREE:交联葡聚糖凝胶（Sephadex）

葡聚糖和3-氯-1，2环氧丙烷以醚键相互交联形成。

按交联度大小分8种型号，G值代表不同交联度。

?SephadexG-10，15，25，50，75，100，150，200

数字表示每克干胶膨胀时吸水量的10倍。SephadexG-25代表每克干胶膨胀时可以吸水2.5克。

G值越小，交联度越大，网孔越小，吸水膨胀越小，只能分离相对分子量小的物质；G值越大，交联度越小，网孔越大，吸水膨胀越大，可以分离相对分子量大的物质；

分离范围Mr（肽和球蛋白）

SephadexG-25??????????1000-5000?

SephadexG–50?????????1500-30000

SephadexG–75?????????3000-70000??

补充说明：凝胶过滤层析特点

?设备简单，操作方便

?分离条件温和，样品回收率高（100%）

?实验重复性好

除盐：

??选择孔径小，交联度大的凝胶。

??SephadexG-25???????全排出的最小分子量为5000?

??SephadexG–50??????全排出的最小分子量为30000（除盐的蛋白质分子量必须大于30000，消除凝胶对蛋白质的滞留作用。）

??当分子量未知时，选择SephadexG-25?

??洗脱时，大分子受阻小最先流出，小分子受阻大而最后流出，结果使大小不同的物质分离。用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。

??用于分离及测定样品分子量：标准分子量样品，logMW对洗脱体积作图

实验器材与试剂

器材：每组1×20cm层析柱、馏份自动收集器、泵（两组一台）、铁架台（带蝴蝶夹）、玻璃棒、500ml烧杯（装柱用）1个、100ml烧杯2个、一次性滴管、多余的垫圈。

试剂：

葡聚糖凝胶Sephadex-50：蛋白质工作范围：1500－30000，得水值＝5.0g/g干胶，最小溶胀时间：室温6h，沸水浴2h。

取Sephadex-5015g，加500加500ml蒸馏水室温溶胀1天（或沸水中溶胀1h），待溶胀平衡后，顷去上清液，包括细颗粒，然后再放些蒸馏水搅乱，静置使凝胶下沉，再倾去上清液，至无细颗粒为止（泡久一些再使用，可用水浴锅加热）。

①：6mg/ml蓝色葡聚糖溶液：蓝色葡聚糖180mg----30ml。

②：30mg/ml细胞色素C溶液（MW＝12327）：240mg----8ml细胞色素C。

③：2mg/ml重铬酸钾溶液（MW＝294.18）：重铬酸钾60mg---30ml。

①、②、③溶液各取6滴于1ml离心管中混匀，每组1份。置冰箱中保存，或临时配制。

PH8.2洗脱液：

配制2mol/L的氯化钠水溶液500ml；

配制2mol/L的碳酸钠水溶液500ml；

配制10mmol/L的氯化钠水溶液1L（用2mol/L的氯化钠水溶液1:200稀释），然后用2mol/L的碳酸钠（此浓度调ph过高，可适当稀释后使用）调PH至8.2。

实验操作

1、凝胶溶胀：

取SephadexG-5015g，加500ml蒸馏水室温溶胀一天（或沸水浴中溶胀1h）。

待溶胀平衡后，倾去上层清液，包括细颗粒，然后再放些蒸馏水搅乱，静置使凝胶下沉，再倾去上层清液，至无细颗粒为止。?

不能剧烈搅拌，严禁用磁力搅拌器，否则易破碎，使流速下降和分离效果降低。

2、装柱：

取1×20cm层析柱，底部出口套上乳胶塑料管，向层析柱内加蒸馏水(赶走层析柱下过滤层死体积和接口处的气泡)，在蒸馏水高度约占层析柱高1/3时，关闭下端出口（用橡皮筋）。

自顶部缓缓加入Sephadex-50悬液，待底部凝胶沉积1-2cm时，打开下端出口，凝胶加至离层析柱顶部约3cm。

用蒸馏水过柱几遍，以稳定床体积(不能让凝胶表面露出水