GBT 35806-2018 动物流感检测 H7N9亚型流感病毒双重荧光RT-PCR检测方法.docxVIP

ICS11.220B41

中华人民共和国国家标准

GB/T35806—2018

动物流感检测H7N9亚型流感病毒双重荧光RT-PCR检测方法

Animalinfluenzadetection—Protocolofduplexreal-timeRT-PCRforinfluenzavirussubtypesH7andN9

2018-02-06发布2018-09-01实施

中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会

发布

I

GB/T35806—2018

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。

本标准由农业部提出。

本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。

本标准起草单位：北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心、中国出入境检验检疫协会、中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、中国检验检疫科学研究院。

本标准主要起草人：蒲静、高志强、汪琳、乔彩霞、张锡全、周琦、张鹤晓、张伟、尹羿、柏亚铎、刘艳华、刘环、王秀荣、包红梅、韩雪清、王慧煜。

1

GB/T35806—2018

动物流感检测H7N9亚型流感病毒双重荧光RT-PCR检测方法

1范围

本标准规定了同时检测H7和N9亚型动物流感病毒核酸的TaqMan双重荧光RT-PCR操作方法。

本标准适用于H7和N9亚型动物流感病毒核酸的快速检测和筛查。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T19438.1—2004禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法GB19489实验室生物安全通用要求

3缩略语

下列缩略语适用于本文件。

Ct(或Cp)值：每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值所经历的循环数(ThresholdCycle,orCrossingPoint)

DEPC:焦碳酸二乙酯(Diethypyrocarbonate)FAM:羧基荧光素(Carboxyfluorescein)

HA:血凝素(Hemagglutinin)

HEX:六氯-6-甲基荧光素(Hexachlorofluorescein)MGB:小沟结合物(MinorGrooveBinder)

NA:神经氨酸酶(Neuraminidase)

TAMRA:羧基四甲基罗丹明(Carboxytetramethylrhodamine)

荧光RT-PCR:实时荧光反转录聚合酶链反应(Real-timeRT-PCR)

4试剂和材料

4.1试剂

4.1.1总则：除另有说明，所用试剂均为分析纯，所用液体试剂均需使用无RNA酶的容器进行分装。

4.1.2TRIzol:2℃~25℃保存。

4.1.3氯仿：2℃~8℃预冷。

4.1.4异丙醇：-20℃预冷。

4.1.5DEPC水：配方见A.1。

2

GB/T35806—2018

4.1.675%乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，-20℃预冷。

4.1.7PBS(含青霉素和链霉素):配方见A.2。

4.1.8H7和N9亚型流感病毒双重荧光RT-PCR检测引物、探针序列，反应液配方见附录B。

4.1.9阳性、阴性对照

阳性对照：为灭活的H7N9亚型流感病毒液或体外转录的H7和N9cRNA。阴性对照：为已知流感病毒阴性的动物组织悬液。

4.2仪器设备

4.2.1荧光PCR检测仪及配套反应管(板)。

4.2.2高速台式冷冻离心机(离心速度不低于12000r/min)。

4.2.3台式离心机。

4.2.4振荡器。

4.2.5组织匀浆器。

4.2.6冰箱(2℃-8℃和-20℃两种)。

4.2.7微量移液器(5pL、10μL、100μL、1000μL)及配套吸头。

4.2.81.5ml离心管(无核酸酶)和5mL采样管。

5实验室的标准化设置与生物安全管理

本方法的实验室设置与管理见GB19438.12004中的附录C;实验室生物安全管理见

GB19489。

6样品的采集与前处理

6.1总则

采样过程中样本不得交叉污