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高良姜素对LPS诱导THP-1细胞炎症的保护作用

［摘要］目的：探讨高良姜素对脂多糖（LPS）诱导人急性单核细胞白血病细胞株THP-1细胞炎症的保护作用及其可能的机制。方法：MTS法检测细胞活性；酶联免疫吸附（ELISA）法检测TNF-α、MCP-1、IL-1β、IL-6的分泌；免疫印迹（WesternBlot）法检测NF-κB以及MAPK通路相关蛋白的变化。结果：高良姜素在0-20μmol/L范围内对细胞活力无明显影响。LPS的用药浓度为500ng/mL；与LPS模型组相比，高良姜素2.5-20μmol/L能有效抑制炎症因子TNF-α、MCP-1、IL-1β、IL-6的释放（P＜0.05）；高良姜素20μmol/L能抑制NF-κB通路IκBα的磷酸化，从而减少核转位因子NF-κB的核转位，但对MAPK通路无影响；结论：高良姜素对LPS刺激的THP-1细胞炎症具有一定的保护作用，其保护机制可能与其调控NF-κB通路，抑制IκBα的磷酸化，减少NF-κB的核转位，进而抑制TNF-α、MCP-1、IL-1β、IL-6的表达有关。

［关键词］：高良姜素；THP-1；脂多糖；抗炎；NF-κB;MAPK

高良姜素(galangin)是一种天然的黄酮醇类化合物,近年来国内外对该成分的药理药效活性进行了大量研究,实验证明高良姜素具有抗肿瘤、抗氧化、抗纤维化等作用ADDINNE.Ref.{8BAD2C36-1F3B-44E6-A9EF-4178C212D7C7}[1-3]，而关于其抗炎活性方面的研究较少。巨噬细胞分泌多种炎症介质介导炎症反应，包括TNF-α、MCP-1、IL-1β、IL-6ADDINNE.Ref.{D3D4D2DA-1820-4AAD-BF17-05F913DFBBB9}[4]等，而这些炎症介质的产生与NF-κB以及MAPK（mitogen-activatedproteinkinase）通路有着密切的关系ADDINNE.Ref.{142AD3DF-9A60-4D40-A439-A1328A3D8183}[5,6]。基于此，本实验选用LPS诱导THP-1细胞作为体外炎症模型，探讨高良姜素在该模型中是否具有抗炎作用以及抗炎的机制。

1.材料

1.1.1药品与试剂高良姜素（广东省食品药品检验所,批号62.111699）；THP-1细胞系购自上海细胞库；LPS（sigma，批号L2880）；MTS（promega）；ELISA试剂盒（达科为）；IκBα、p-IκBα、p-JNK、JNK、ERK、p-ERK、P38、p-p38、GAPDH、PCNA、NF-κB(P65)(cellsignalingtechnology)。

1.1.2仪器

超净工作台（Thermo）、细胞CO2培养箱（newbrunswick）、普通光学显微镜（Leika）、多功能酶标仪（biotek）、台式冷冻离心机（EppendorfResearch）、高压蒸汽灭菌锅（HIRAYAMA）、电泳仪（Bio-Rad）。

2.方法

2.1MTS法检测高良姜素对LPS刺激后THP-1细胞增殖的影响：实验分组：对照组、LPS刺激组（500ng/mL）、4个不同浓度高良姜素处理组（2.5、5、10、20μΜ/L）、4个不同浓度高良姜素（2.5、5、10、20μΜ/L）+LPS处理组。在37℃,5%CO2培养箱内培养6、12、24h后,每孔加入20ulMTS溶液,继续培养2-4h，酶标仪测490nm下吸光度。

2.2ELISA法检测高良姜素对LPS刺激THP-1细胞表达TNF-α、MCP-1、IL-1β、IL-6的影响

实验分组（同2.1），分别培养6h、12h、24h，收集3个时间段细胞上清，按照ELISA试剂盒说明书的要求进行操作，最后使用酶标仪进行检测，测得的数据经电脑软件处理。

2.3高良姜素对LPS刺激THP-1细胞NF-κB通路以及MAPKs通路的影响

实验分组：空白对照组，500ng/mLLPS处理组（分别处理15min、30min、45min）、500ng/mLLPS+20μmol/L高良姜素组（分别处理15min、30min、45min）。根据实验分组，制备蛋白上清，调整蛋白浓度，电泳，转膜，封闭，孵育一抗，孵育二抗，显色，曝光。

2.4高良姜素对LPS刺激后THP-1细胞NF-κB（P65）转位的影响

实验分组：空白对照组、LPS（500ng/mL）组、20μmol/L高良姜素组、LPS+20μmol/L高良姜素组。药物作用12h后，按照核蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒说明书要求分别提取核蛋白以及胞浆蛋白，westernBlot法检测NF-κB（P