临床免疫学检验：实验一 抗血清的纯化.ppt

****实验一抗血清的纯化概述抗血清：机体经抗原免疫后含特异性抗体的血清抗血清是成分复杂的混合物，除含有特异性抗体外，还存在非特异性抗体和其他血清成分。抗血清纯化的目的是尽量去除抗血清中与目的抗体不相关的成分，以防止其对实验结果产生影响。抗血清纯化的方法主要有粗提法和精制法两个过程。前者常用硫酸铵盐析法，后者分非特异性和特异性两种类型。--非特异性方法：葡聚糖凝胶过滤法、离子交换层析法--特异性方法：免疫吸附法盐析分离的抗体中含有大量盐分，需要将沉淀复溶进行去盐处理才能应用，通常采用凝胶过滤法或透析法。实验目的本次实验利用硫酸铵盐析法对抗血清进行初步纯化，并用凝胶过滤法对纯化后的抗体进行脱盐处理。通过本次实验，理解抗血清纯化的目的和方法，并熟悉其操作过程。实验原理盐析：不同性质的蛋白质在不同浓度的盐溶液中相对溶解度不同，血清免疫球蛋白（Ig）在一定浓度盐溶液中易于沉淀，而白蛋白则不易沉淀，据此可将两者分离。分离纯化Ig最常用硫酸铵（中性盐），33%的硫酸铵可以选择性沉淀IgG。凝胶过滤法：也称分子筛层析法，是利用具有网状结构的凝胶颗粒的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。实验材料试剂：葡聚糖凝胶G-25（SephadexG-25）、饱和硫酸铵溶液、0.2mol/LPBS（pH7.0）器材：离心管、层析柱、铁架台、核酸蛋白检测仪、紫外分光光度计、一次性滴管、烧杯标本：抗血清实验步骤（一）盐析取2ml抗血清于15ml离心管中，加入2mlPBS。室温下，边摇动离心管边滴加2ml饱和硫酸铵溶液。置室温15min后，离心3500rpm×10min，弃上清。沉淀物用2mlPBS重悬。（二）凝胶过滤装柱在层析柱中先加入少量PBS将出水管中的气泡赶掉，再将SephadexG-25凝胶液搅匀倒入层析柱中。层析柱中的液面边下降边加SephadexG-25凝胶液，一直到柱中凝胶实体高度到达层析柱高度的三分之二左右时，停止加凝胶液。平衡柱子用PBS平衡柱子5min，平衡后将柱子的出水口和核酸蛋白检测仪连接。调节核酸蛋白检测仪选择波长为280nm，调0和调100％。电源2A时调0钮电压选择钮进水口100%时调100钮波长选择钮出水口****