临床免疫学检验：实验五 酶联免疫吸附试验.ppt

*******实验五酶联免疫吸附试验

概述酶联免疫吸附试验（ELISA）是临床最常用的酶免疫分析技术，属于固相酶免疫测定。三个关键材料：固相的抗原或抗体、酶结合物、酶作用的底物方法类型：夹心法、竞争法、间接法、捕获法双抗体夹心法测抗原+-EEEEEEEEE竞争法测抗原+-EEEEEEE2、加待检物抗原与酶标抗原竞争与抗体结合3、加酶作用的底物不显色或显色弱3、加酶作用的底物显色1、已知抗体包被于载体表面1、已知抗体包被于载体表面2、加待测物和酶标抗原，酶标抗原与抗体结合E间接法测抗体-EEEEEEEEE+捕获法原理+-EEEEE1、固相化抗人IgM1、固相化抗人IgM2、加待测物特异性IgM与非特异性IgM和抗人IgM结合3、加特异性抗原，与特异性抗体结合4、加酶标抗体与特异性抗原结合，加底物显色2、加待测物只有非特异性IgM和抗人IgM结合3、加特异性抗原，不能与非特异性IgM结合4、加酶标抗体无抗原结合，加底物不显色实验目的本次实验以双抗体夹心法检测乙型肝炎表面抗原（HBsAg）为例，来验证酶联免疫吸附试验的基本原理，并通过实验熟悉其操作过程及临床应用实验原理筛选两种抗-HBsAg（针对不同抗原表位），一种连接于固相载体制备酶标反应板，另一种标记过氧化物酶制备酶标抗体；测定时，待测抗原分别与固相抗体和酶标抗体结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体双抗体夹心复合物；加入底物后显色，并通过测定吸光度来判读结果。实验材料试剂：酶标记反应板、酶结合物、底物A、B液、终止液、洗液、阳性质控血清、阴性质控血清器材：加样枪、加样头、水浴箱、酶标仪标本：待测血清1~3（高、中、低浓度）实验步骤加样：分别加入1～3号标本各50μl（做双孔），在7、8孔位分别加入阴、阳性对照各一滴（50μl），37℃水浴箱60分钟。加酶结合物：各孔加入酶结合物各一滴（50μl），混匀，置37℃水浴箱30分钟。洗板：弃去，加洗涤液注满各孔，静置30秒，弃去，拍干，重复5次。显色：分别加入底物A、B液各一滴，混匀，置37℃水浴箱10分钟。加终止液：每孔加50μl。比色：用酶标仪测定吸光度，波长设定为450nm。*******