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DNA测序策略

开始测序之前，必须根据待测序列的长度，所要求的测序精确度

以现有条件制订总策略。DNA的测序策略因待测DNA分子的性质、测

序方法和测序目的不同而有所不同。只有一小部分的研究需从头测定

未知序列，而更多的情况是通过测序对突变（如点突变和缺失）进行

定位和鉴定，或证实构建的重组DNA的方向与结构，即对已知序列的

确证性测序。

一、确证性测序策略

多数情况下，测序是对已知的核酸序列进行鉴定和证实，即确证

性测序（confirmatorysequencing）。如临床分子诊断，病源微生

物保守序列分析，次级克隆DNA的插入方向、突变（如点突变和缺失）

的检测，酶切产物的鉴定和待表达基因阅读框架的判定等。

这类DNA片段通常较小，只需克隆到测序载体中，进行单链或双

链模板测序，也可对PCR产物进行直接测序。对于一个稍大的DNA片

段，可利用通用引物分别从两端进行双向测序，再通过中间重叠部分

拼出全序列。对于更大的DNA序列，可以在序列中间的适当区域增加

一个或数个测序引物，分别测序，拼出全序列，最后与已知序列比较

即可。

二、从头测序策略

从头测序（denovosequencing）目的是确定一未知DNA序列的

准确长度及核苷酸排列顺序。未知序列可长达数千碱基，测序策略因

其长度而异。

由于单套测序反应所能准确测定的靶DNA序列最长可达500个碱

基左右，因此从头测序必须经过精心策划。长约500个碱基的DNA可

以按互为相反的方向分别克隆于两种M13噬菌体载体（如M13mp18和

M13mp19）或质粒系统（如pUC18等）上。然后每条链的全序列可以

利用通用测序引物进行的单套反应得以测定。如果要对更长的靶DNA

（如长达数千碱基的大片段或全基因组）进行精确测序，就必需将其

切割成适当大小的多个片段（300～400bp），分别进行次级克隆再进

行测序，最后拼出全序列。可在下列两种通用策略中择一而行。

（一）随机测序法

随机测序法的特点是无特定方向性，随机对靶DNA进行测序，最

后通过计算机拼装而得到完整的序列信息。在随机法中，序列资料是

从含有靶DNA随机片段的亚克隆中收集而来的。既不需确定这些亚克

隆在靶DNA中的位置，也不必查明究竟测出的是哪一条链的序列，只

要把积累资料贮存起来，最后用计算机排列妥当。这一方法是由剑桥

的医学研究委员会（M.R.C.）实验室率先推行的，曾经成功地用于测

定人线粒体DNA、人腺病毒DNA、λ噬菌体DNA以及Epstenin-Barr

病毒DNA等的序列。主要包括鸟枪法与人工转座子法。

1.鸟枪法

鸟枪法（shotgunmethod）是先利用DNaseⅠ、超声波或限制性

核酸内切酶处理，将靶DNA大片段随机切割成小片段，并进行亚克隆，

然后分别测定亚克隆序列，最后通过计算机拼装获得靶DNA全序列

（图-1）。

图-1鸟枪法测序原理

1995年流感嗜血杆菌（Haemophilusinfluenzae）全基因组序

列被完成，这是完全用鸟枪法策略直接完成的，说明鸟枪法用于微生

物基因组测序是有效的。研究者直接将全基因组DNA切成1.6～2.0kb

大小的片段分别克隆，构成全基因组的基因文库，从基因文库中随机

挑选19687个克隆，进行了28643个测序反应，测定各个克隆片段

末端的序列，有些克隆片段的两端都进行了测序。除去测序失败的部

分，测序得到的序列长度为11631485bp，相当于流感嗜血杆菌基

因组全长的6倍，以确保覆盖了全基因组序列。

鸟枪测序法的优点是成本低、快速、易于自动化操作。现在普遍

认为，任何小于5Mb的基因组序列，即使不知道其基因组的任何信息，

都可以在1年内测完它的全部序列，这就是鸟枪法最大的优点。但它

的缺点是由于测序的亚克隆是随机挑选出来的，某些序列往往被重复

测定，而一些区段迟迟不出现，通常所要测定的序列会比靶DNA多4～

7倍，因此在测序后期，大量重复测序使测序效率变低。另外，鸟枪

法采用计算机将许多小片段连接成长的序列重叠群，需要大量的数据

分析工作，达到了目前计算机系统处理能力的极限