常规PCR实验(共33张PPT).pptxVIP

常规PCR实验;

掌握：

1、PCR的基本操作方法。

2、琼脂糖凝胶电泳检测DNA的基本原理和方法。

理解：

1、PCR仪的使用方法。

了解：

1、PCR体外扩增的原理及其引物设计原则。

2、扩增过程中各因素对扩增结果的影响。;1、PCR反应体系的建立。

2、琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。;一、基本原理;;Cycle2;重新设计引物或者使用巢式PCR

100mlTAE电泳缓冲液中加入1g琼脂糖，摇匀后放入微波炉中，小火加热几分钟至溶液透明位置，取出后冷却至56℃左右时，加入微量（3.

4、按操作步骤正确设置使用PCR仪。

预变性：94℃5min

4种dNTP在反应中浓度应相等，过高会抑制Taq酶活性，增加错配的几率。

实验步骤一：PCR反应体系的建立（重点）

双链DNA模板被加热变性成两条单链

反应缓冲液（含Mg2+）

因此，在某些时候可选择具有校读活性的聚合酶例如Pfu；

具有5’→3’DNA聚合活性外，还具有5’→3’DNA外切活性。

PCR反应程序的设计（难点）

可以根据需要选择扩增长片段的Taq酶，高速扩增的Taq酶等

双链DNA模板被加热变性成两条单链

电泳100V，10min左右。

1、注意移液枪的正确使用方法。

M12

浓度太低，影响扩增效率和产率。

聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）：;琼脂糖凝胶电泳原理;二、操作步骤;模板DNA

特异性引物

耐热DNA聚合酶(如Taq酶)

dNTPs

反应缓冲液（含Mg2+）;;PCR反应程序的设计（难点）

预变性：94℃5min

变性：94℃30sec

退火：55℃30sec

延伸：72℃40sec(60sec)

最终延伸：72℃5min

保存：4℃forever;PCR程序设计的主要因素;主要实验仪器;

;实验步骤三：结果检测;不同类型琼脂糖分离DNA片段大小的范围;3.上样

反应结束后取5μL反应产物，加入1μL上样缓冲液（6×loadingbuffer），用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

指示剂：溴酚蓝

Marker：DL2000。

注意：

加样孔位于负极，DNA由负极向正极泳动;4.电泳

电泳100V，10min左右。;三、注意事项;四、影响PCR反应的因素;3、引物(引物的好坏是整个PCR反应的关键)

引物浓度一般为0.1～0.5mmol/L，浓度太高，会增加非特异性扩??，形成引物二聚体；浓度太低，影响扩增效率和产率。

*引物设计的原则

长度15～30bp

GC含量45～55%

两条引物退火温度一致或接近，Tm差值小于5℃

无连续核苷酸

引物内部及引物间无互补，以免形成发夹结构和引物二聚体;特异性的引物：特异性的产物;4、Mg2+浓度

Mg2+是DNA聚合酶发挥作用的必须成分；

最适浓度一般为0.5-2.5mmol/L,浓度过低则无法启动反应，过高则影响产物特异性。;5、TaqDNA聚合酶

具有5’→3’DNA聚合活性外，还具有5’→3’DNA外切活性。因此，在某些时候可选择具有校读活性的聚合酶例如Pfu；

可以根据需要选择扩增长片段的Taq酶，高速扩增的Taq酶等

反应终浓度以2～2.5U/100μl为最佳

;五、问题分析;问题1：无扩增产物;纯度：含有抑制物

浓度：含量低

质量：全长

结构：二级结构

;引物错误

引物设计不好

引物降解

引物合成、纯化不好;退火温度

延伸时间

循环次数;现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带;引物特异性差

模板或引物浓度过高

酶量过多

Mg2+浓度偏高

退火温度偏低

循环次数过多;

靶序列或扩增产

物的交叉污染。