干扰素的工艺制备流程(共33张PPT).pptxVIP

干扰素的工艺制备流程;1.1天然干扰素的分类;提高单核巨噬细胞、树突状细胞的抗原提呈能力

增强Tc细胞和NK细胞的杀伤活性

抑制TH2细胞形成，下调体液免疫应答

趋化作用

抗病毒和抗肿瘤作用（次要）

2.根据动物来源确定分类

人干扰素（HuIFN），小鼠干扰素（MuIFN）。

;;1.2重组干扰素的临床应用;2基因工程大肠杆菌发酵生产工艺;干扰素生产工艺路线;目的基因的分离;一、目的基因的分离与扩增;二、构建重组质粒;三、重组体引入宿主细胞;四、受体菌的筛选;五、分析保存;干扰素的发酵工艺过程;破碎菌体：2厘米以下的碎块

干扰素结构鉴定：紫外光谱，肽谱，N端序列

以cDNA为模板、干扰素引物为引物，PCR，得到完全的干扰素基因的PCR产物

提高单核巨噬细胞、树突状细胞的抗原提呈能力

增强Tc细胞和NK细胞的杀伤活性

抑制TH2细胞形成，下调体液免疫应答

趋化作用

抗病毒和抗肿瘤作用（次要）

2.

同半成品检定。

0后，用5℃冷却水快速降温至15℃以下，以减缓细胞衰老。

来源：活化的T细胞和NK细胞产生

（11）等电点测定等电聚焦电泳。

（6）残余外源性DNA含量测定

0后，用5℃冷却水快速降温至15℃以下，以减缓细胞衰老。

超纯水，pH7.

基因工程大肠杆菌发酵生产工艺:

检查:缓冲液的pH值和电导值。

基因工程大肠杆菌发酵生产工艺:

保存：收集沉淀，粗干扰素，4℃保存。

根据来源、基因序列和氨基酸组成分类;3.发酵罐培养将种子液通入300L培养基的发酵罐中，接种量10%，培养温度30℃，pH7.0。级联调节通气量和搅拌转速，控制溶解氧30%，培养4小时。然后控制培养温度20℃，pH6.0，溶解氧60%，继续培养5～6.5小时。同时进行发酵液杂菌检查，当OD值达9.0±1.0后，用5℃冷却水快速降温至15℃以下，以减缓细胞衰老。或者将发酵液转入收集罐中，加入冰块使温度迅速降至10℃以下。

4.菌体收集将已降温的发酵液转入连续流离心机，16000r/min离心收集。进行干扰素含量、菌体蛋白含量、菌体干燥失重、质粒结构一致性、质粒稳定性等项目的检测。菌体??－20℃冰柜中保存时，不得超过12个月。每保存3个月，检查一次活性。

;3.干扰素的分离纯化工艺过程;3.1干扰素分离工艺过程;(1)菌体裂解

;(2)预处理-沉淀;(3)离心

;（4）初级分离

;3.2、干扰素纯化工艺过程;(1)溶解粗干扰素

;(2)沉淀与疏水层析

;等电点沉淀（2）：磷酸调节pH4.5，调节电导值40ms/cm，2℃～10℃，静置过夜

超滤：1000ku超滤膜过滤，除去大蛋白。

透析除盐：调整溶液pH8.0，电导值，10ku超滤膜，0.005M缓冲液。

;连续流离心机：2℃～10℃，16000r/min

1990，rhuIFNγ-1b；

01M磷酸缓冲液（pH8.

将cDNA克隆到含有四环素、氨苄青霉素抗性基因的质粒中，转化到大肠杆菌，重组的载体DNA分子在一定条件下转化入大肠杆菌，形成携带质粒的菌株。

1990，rhuIFNγ-1b；

（6）残余外源性DNA含量测定

根据来源、基因序列和氨基酸组成分类

疏水层析：干扰素吸附在疏水层析柱中

重组体导入大肠杆菌K12

直接抗肿瘤活性（rhuIFNα）

（6）残余外源性DNA含量测定

除非疏水性蛋白

提高单核巨噬细胞、树突状细胞的抗原提呈能力

增强Tc细胞和NK细胞的杀伤活性

抑制TH2细胞形成，下调体液免疫应答

趋化作用

抗病毒和抗肿瘤作用（次要）

2.

另外重组过程可能会发生基因突变情况

1990，rhuIFNγ-1b；

0，沉淀杂蛋白，离心收集上清液。;(4)检测项目

;半成品检定;（5）相对分子量测定

还原型SDS，加样量不地域微克，同时用已知相对分子量的蛋白标准系列做对照，以迁移率为横坐标，相对分子量的对数为纵坐标作图，计算相对分子量。与理论值比较，误差不得高于10%。

（6）残余外源性DNA含量测定

用放射性核素或生物素探针法测定，每剂量中残余外源性DNA应低于100pg。

（7）残余血清IgG含量测定

在应用抗体亲和层析法作为纯化方法时必须进行此项检定。

（8）残余抗生素活性测定

半成品中不应有抗生素活性存在。

;

（9）紫外光谱扫描

检查半成品的光谱吸收值，最大吸收值应在280±2纳米。

（10）肽图测定

用CNBr裂解法，测