指状青菌的分离培养方法.docxVIP

、真菌的分离培养方法

（―）平板划线分离法

取适合指状青霉的琼脂培养基融化，冷至45°C，注入无菌平皿中，每皿15?20ml,制成平板待用。

如面包、水果、蔬菜等含碳水化合物多的食物上真菌的生长比较明显，可用接种针挑取孢子后直接作划线分离。

取要分离的材料（如田土、混杂的或污染的真菌培养物、真菌）少许，投入盛无菌水的试管内，振摇，【或放在三角瓶中，放几颗玻璃珠，震荡摇晃20分钟】使分离菌悬浮于水中。

将接种环经火焰灭菌并冷却后，蘸取上述菌悬浮液，进行平板划线（同细菌的划线法）。

划线完毕，置温箱中培养2?5d，待长出菌落后，钓取可疑单个菌落先作制片检查，若只有一种所需要的真菌生长，即可进行钓菌纯培养。如有杂菌可从单个菌落中钓少许菌制成悬液，再作划线分离培养，有时需反复多次，才得纯种。另外，也可在放大镜的观察下，用无菌镊子夹取一段待分离的真菌菌丝，直接放在平板上作分离培养，可获得该种真菌的纯培养。

（二）稀释分离法

取盛有无菌水的试管5支（每管9ml或10ml），分别标记1、

2、3、4、5号。取样品（如田土等1g，水果真菌孢子），投入1号管内，振摇，使悬浮均匀。

用1ml灭菌吸管，按无菌操作法，从1号管中吸取1ml悬浮

液注入2号管中，并摇匀；同样由2号管取1ml至3号管，依此类推，直至5号管。注意每稀释一管应更换一支灭菌吸管。

用2支无菌吸管分别由4号、5号试管中各取1ml悬液，并分别注入2个灭菌培养皿中，再加入融化后冷至45°C的琼脂培养基约15ml,轻轻在桌面上摇转，静置，使冷凝成平板。然后倒置温箱中培养，2?5d后，从中挑选单个菌落，并移植于斜面上。

二.指状青霉培养性状观察

指状青霉\真菌界\无性型真菌门\半知菌纲(FungiImperficti)\壳霉目(Sphaeropsidales)\杯霉科(Discellaceae)指状青霉属指状青霉

指状青霉在固体培养基上的生长表现：

菌落：将不同霉菌在固体培养基上培养2?5d，可见霉菌菌落呈绒毛状、絮状、蜘蛛网状等。菌落大小依种而异，有的能扩展到整个固体培养基，有的有一定的局限性(直径1?2mm或更小)。很多霉菌的孢子能产生色素，致使菌落表面、背面甚至培养基呈现不同的颜色，如黄色、绿色、青色、黑色、橙色等。

识别特征：

菌落绒状，暗黄绿色,后变橄榄灰，有特殊的香味;侵害柑橘果实，引起绿霉病。

生殖特征：

分生孢子梗短，帚状枝大而不规则;产孢瓶体在不同的高度上形成；分生孢子卵形至圆柱形。

三.指状青霉的形态观察

（一）真菌水浸片的制备及观察

常用美兰染色液制备真菌水浸片来观察真菌的菌体形态，并且活细胞能还原美蓝为无色，故可区别死细胞、活细胞。

将美兰染色液一滴滴加在干净的载玻片中央，如不染色则加蒸馏水一滴，用解剖针挑取培养3~5天的少量菌丝体放在载玻片的液滴中，将玻片置于解剖镜下，细心地用解剖针将菌丝体分散成自然状态，并加盖干净盖玻片。为避免产生气泡，应先将其一边接触液滴，再慢慢放下盖片，然后置于显微镜载物台上进行观察。

观察时注意它们的菌丝有无隔膜、孢子囊柄与分生孢子柄的形状、分生孢子小梗的着生方式、孢子囊的形态、足细胞与假根的有无、孢子囊孢子和分生孢子的形状和颜色、节孢子的形状和特点等。