微生物学第八章微生物与基因工程.pptVIP

宿主基本要求是：

①能够高效吸收外源DNA；

②具有使外源DNA进行高效复制的酶系统；

③不具有限制修饰系统，故不会使导入宿主细胞内未经修饰的外源DNA发生降解；

④一般为重组缺陷型（RecA-）菌株，使克隆载体DNA与宿主染色体DNA之间不发生同源重组；

⑤便于进行基因操作和筛选；

⑥具有安全性。第31页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三原核生物的大肠杆菌及真核生物的酿酒酵母，由于他们具有生长迅速、极易培养，能在廉价培养基上生长，遗传学和分子生物学背景十分清楚等突出优点，已成为当前被广泛应用的重要克隆载体宿主。另外还有枯草杆菌和昆虫细胞系等。第32页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三第二节基因工程的基本过程基因工程操作主要步骤为：①分离或合成基因（切），②通过体外重组将基因插入载体（接），③将重组DNA导入细胞（转），④扩增克隆基因（增），⑤筛选重组体克隆（检），⑥对克隆的基因进行鉴定或测序，⑦控制外源基因的表达，⑧得到基因产物或转基因动物、转基因植物、工程菌（利用基因工程技术获得的具有新功能的微生物称为工程菌）。第33页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三第34页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三第35页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三一、目的基因的分离或合成1，从基因文库中筛选基因文库是指生物染色体基因组各DNA片断的克隆总体（即某一特定生物体全基因组的克隆集合）。人们可以根据目的基因的性质和序列从中筛选。第36页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三2，cDNA法目的DNA可用反转录酶以mRNA为模板来合成。（以该蛋白质的单克隆抗体纯化该基因的核糖体，再洗脱下编码该蛋白质的特异mRNA，直接反转录成cDNA，进行基因克隆。）cDNA文库是指生物体全部mRNA的cDNA克隆总体。cDNA文库中的每一个克隆只含一种mRNA信息。根据目的基因的特性可从中筛选。第37页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三3，化学合成法如果目的基因的全序列是已知的，则可以利用化学合成法直接合成。2kb的基因序列。第38页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三二、体外重组目的基因用酶切下来，同时打开载体DNA分子，然后将两者连接成杂合分子。第39页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三三、重组DNA导入细胞DNA重组分子在体外构建完成后，必须导入特定的受体细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。重组DNA人工导入受体细胞有许多方法，包括转化、转染、接合、受体细胞的电穿孔和显微注射等等。第40页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三1，外源DNA导入原核细胞（1）转化或转染如果外源DNA以重组质粒载体形式存在，则可通过转化导入原核细胞；如果外源DNA被构建成重组噬菌体DNA或重组噬菌体质粒，则可通过转染方式进入细胞。第41页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三（2）λ噬菌体的体外包装和感染如果外源DNA被包装成λ噬菌体颗粒，则可通过噬菌体感染机制导入细胞。体外包装是将重组DNA分子与噬菌体的头部、尾部以及有关包装蛋白混合，从而组装成完整的具有感染力的λ噬菌体粒子。第42页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三2，外源DNA导入真核细胞（1）外源DNA导入酵母细胞重组DNA以转化方式导入酵母细胞的原生质体。（2）外源DNA导入哺乳动物细胞微量注射和电穿孔法为主，还有磷酸钙共沉淀转染法、聚阳离子转染法、原生质体融合法等等。第43页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三（3）外源DNA导入植物细胞有微量注射、电穿孔法、共培养法、叶片培养法、基因枪法等等。第44页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三共培养法：共培养法是指将含有重组Ti质粒的根癌土壤杆菌与植物原生质体共培养。叶片培养法是指含有重组Ti质粒的根癌土壤杆菌与植物叶片共培养。基因枪法是利用微弹把表面吸附有外源DNA的金属微粒高速射进植物的细胞、组织或幼苗。第45页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三四、转化细胞的扩增转化细胞的扩增是指受体细胞经转化后立即进行短时间的培养。如原生质体转化后的细胞壁再生等。第46页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三五、转化子的筛选和重组子的鉴定在制备目的基因时对染色体进行了切割，产生大量的DNA小片断，故进入受体细胞的克隆不仅有目的基因，而且有大量不需要的基因，所获得的是含有不同克隆子的细胞群体。在DNA体外重组中，外源DNA片断与载体DNA的连接反应物一般不经分离直接用于转化，