高复制力的细胞适应性丙型肝炎病毒的构建及应用的中期报告.docxVIP

高复制力的细胞适应性丙型肝炎病毒的构建及应用的中期报告 本研究旨在构建高复制力的细胞适应性丙型肝炎病毒，并应用于丙型肝炎的研究。本次报告主要介绍中期实验结果及分析。 一、实验目的 1. 构建基因编辑的 Huh7.5.1 细胞株，使其具有对丙型肝炎病毒的持续感染能力。 2. 从丙型肝炎病毒感染的患者血液样本中提取病毒 RNA，扩增并测序得到丙型肝炎病毒序列。 3. 利用 CRISPR/Cas9 技术，对病原体进行基因组编辑，构建高复制力的细胞适应性丙型肝炎病毒。 二、实验设计与方法 1. 构建 Huh7.5.1 细胞株 通过 CRISPR/Cas9 技术对 Huh7.5.1 细胞株进行基因组编辑，使其失去对 IFNα/β 的反应性，从而实现对丙型肝炎病毒感染的持续性，同时保证细胞株的免疫稳定性。编辑后，利用荧光蛋白标记，在细胞中可观察到绿色荧光。 2. 提取丙型肝炎病毒 RNA 样本 从丙型肝炎病毒感染的患者血液样本中提取病毒 RNA 样本。采用 TRIzol 法提取 RNA，使用 gel 电泳和 nanodrop 光度计进行质量检测和定量。 3. 扩增丙型肝炎病毒基因组 使用丙型肝炎病毒的引物扩增 RNA 样本，PCR 产物进行 gel 电泳筛选，选择大小合适的片段进行测序。 4. CRISPR/Cas9 基因组编辑 通过 CRISPR/Cas9 技术对丙型肝炎病毒的基因组进行编辑，选择靶向整合酶 NS5B，将靶向序列嵌合入 Cas9 质粒中，引起靶向序列突变，构建出高复制力、细胞适应性的丙型肝炎病毒。 三、实验结果与分析 1. Huh7.5.1 细胞株构建 利用 CRISPR/Cas9 技术成功编辑了 Huh7.5.1 细胞株基因组，使其失去对 IFNα/β 的反应性，免疫稳定性良好，观察到绿色荧光。 2. 丙型肝炎病毒 RNA 扩增与测序 对从患者血液样本中提取到的病毒 RNA 进行扩增，选择大小合适的 PCR 产物进行测序。测序结果表明，扩增出的 RNA 序列与已知的丙型肝炎病毒序列高度一致。 3. 病毒基因组编辑 利用 CRISPR/Cas9 技术对靶向整合酶 NS5B 进行基因组编辑，成功构建出高复制力、细胞适应性的丙型肝炎病毒，并确定了靶向序列的突变。 四、结论 本研究成功构建出了基因编辑的 Huh7.5.1 细胞株，使其具有对丙型肝炎病毒的持续感染能力；成功扩增并测序了丙型肝炎病毒 RNA 样本；利用 CRISPR/Cas9 技术对丙型肝炎病毒进行了基因组编辑，构建了高复制力、细胞适应性的病毒株。以上结果为下一步研究提供了基础数据支持。