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实验一 显微镜的使用和活菌观察 一、目的要求 1、了解普通光学显微镜的构造。 2、学习显微镜的正确使用维护。 3、学习活细菌形态的观察方法。二、实验说明 显微镜是微生物研究的工具，显微镜种类繁多，有光学显微镜、相差、暗视野、荧光及电子显微镜等。但它们的原理和结构基本相同。下面以普通光学显微镜为例简要介绍其原理及结构。 （一）原理 一般显微镜的光学系统由两部分组成（图 1-1） 成像系统由目镜（a）、棱镜(b)、物镜（c）组成。物镜将标本作第一次放大，然后目镜再将第一次放大的实像作第二次放大。棱镜是专为改变光路用的，物镜光束经棱镜后转向与垂直方向成 45° 角。 照明系统由聚光镜（d）、可变光栏（e）、集光镜（f）和光源（g）组成。光源可选用自然或人工光源，人工光源由钨卤素灯发出，经集光镜平行光，然后聚光镜将外来光线聚在标本上，从而照明了标本，便于观察。 （二）结构 由光学部分（反光镜、聚光器、物镜和目镜）和机械部分（镜座、镜筒、镜臂、转换器、镜台、推动器、粗动螺旋和微动螺旋）组成（图1-2），主要部分件有： 目镜 通常备有 5×、10×、16×，一般选用 10×。 物镜 它对分辩力有着决定性影响。一般有低倍镜（10×）、高倍镜（40×）和油镜（100×），通常按顺序安装在转换器上。 聚光镜 具有使样品明亮的集光作用，同时还影响物像的分辩力和反差，若将聚光镜的光圈开放到超过物镜的数值孔径时，便产生光斑，若收扰光圈，分辩力下降但反差增大。常用聚光镜为二透镜，N.A=1.2，并带有可变光栏和滤光片架。 载物台 又称镜台，载放样品用。一般都装有一个推进器， 可由移动手轮作横向或纵向移动载玻片。 粗调旋转 是调节载物台或镜筒上下移动的装置。细调旋扭转动一圈的升降值为 0.2mm，刻值为 0.002 mm。 （二）显微镜性能 1、数值孔径 显微镜分辩力的高低决定于光学系统的各种条件， 但起决定性影响的是物镜。物镜的性能可用数值孔径（N.A 来表示）。数值孔径又叫开口率，它与显微镜的分辩力成正比，与焦深成反比， 与镜像亮度平方根成正比。 N.A=n.sin a 2 式中：n——物镜与标本间的介质折射率。 a——物镜的镜口角，即光源投射到透镜上的光线和轴之间的最大夹角（图 1-3）。 事实上，a 总是小于 180°，所以sin a 的最大值小于 1。由于 2 空气的折射率为 1 所以，干燥物镜的数值也径总是小于1，一般为 0.05-0.95，油镜物镜如用香柏油（折射率为 1.515）作介质，则数值孔径最大可接近 1.5。虽理论上数值孔径的极限等于所用介质的折射率，但实际上从透镜的制造技术看是达不到的。退常在实用范围内，高级油镜的最大数值孔径为 1.4（图 1-4）。 2、分辨力 分辨力系指分辨物体细微结构的能力。通常用（D） 表示，D= λ ，可见光波长为 0.4-0.8μ m，平均为 0.55μ m。若 2N.A 用数值孔径为 0.65 的物镜，则 D= 0.55 =0.44μ m 这表明被检物体 2×0.65 或其上某结构在 0.44 或其上某结构在 0.44μ m 以上时，以上时可被观察到，若小于 0.44 或其上某结构在 0.44μ m 以上时，就看不清楚。若用数值孔径为 1.25 物镜，则 D=0.22 或其上某结构在 0.44μ m 以上时，若被被检物大于此数值，即可视见，由此可见D 值愈小，分辨力 愈高，物像愈清晰。因此降低波长，增大折射和加大镜口角可提高分辨力。紫外光显微镜和电子显微镜就是利用短波光和电子波来提高分辨力以检视较小的物体。 3、放大倍数 显微镜放大倍数（V）等于物镜放大率（V ）和目 1 镜放大率（V ）的乘积V=V ×V 。 2 2 2 4、焦深在显微镜下观察一个标本时，焦点对在某一像面时，物像最清晰，这像面为目的面。在视野内除目的面外，还能在目的面的上面和下面看见物像，这两个面之间的距离称为焦深。物镜的焦深和开口率及放大率成反比，即开口率和放大率愈大，焦深愈小。因此调节高倍镜比调节低倍镜要仔细，否则容易使物像滑过而找不到。 三、实验器材 显微镜、载玻片、盖玻片、酒精灯、接种环、凹玻片、香柏油、二甲苯。 培养 24-36h 的枯草芽孢杆菌斜面菌种、酵母菌标本片、细菌标本片。 四、实验方法步骤 （一）显微镜使用 1、取镜 打开镜箱、右手握住镜臂，取出显微镜，用左手托住镜座放于平稳的实验台上。镜检者姿势应端正，一般左眼观察，右眼便于绘图或记录。观察时两眼必须同时睁开，以减少疲劳。 2、调光 一般采用散射光，如光线弱时可用日光灯光作光源。 将低倍镜转至镜筒下方，旋转粗调节器，使镜头与载玻台相距 0.5cm。 左眼看目镜，观察光源强弱，调节反光镜（一般用平面镜， 若光线弱时可用凹面镜）、光圈与升降聚光镜使视野内光线