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微生物砷氧化的研究 1 砷氧化酶基因表达调控 微生物羟基反应是指通过酶活性将as（）氧化为as（）的反应。目前发现的大多数砷氧化菌大都分离自从砷富集环境或重金属富集的环境。微生物砷氧化有两点意义:第一是降低环境中毒性较高的As(Ⅲ)浓度,使环境的毒性降低;第二是部分砷氧化菌能够利用砷氧化过程产生的能量进行生长和代谢。砷氧化细菌主要被分为异养型砷氧化菌[heterotrophic As(Ⅲ) oxidizers]和化能自养型砷氧化菌[chemolithoautotrophic As(Ⅲ) oxidizers]。近期研究表明,即使是异养型砷氧化细菌也可能利用砷氧化释放的能量支持生长。 早在1 992年,人们就从Alcaligenes faecalis中纯化得到了砷氧化酶,之后陆续又在多种异养型砷氧化菌和化能自养型砷氧化菌中纯化分离了砷氧化酶。砷氧化酶为砷氧化类微生物所特有,属于含钼(Mo)的二甲基亚砜(DMSO)氧化还原酶家族,由2个亚基构成,其中大亚基是一个含有钼离子中心的[3Fe-4S]簇的硫铁蛋白,小亚基是一个含有[2Fe-2S]簇的硫铁蛋白。砷氧化酶在细菌和古菌中均有发现。根据序列相似度,可以分为2种类型:AioAB型和ArxAB型。 本文主要介绍砷氧化酶基因aioAB的基因表达调控机制。砷氧化基因簇(aio operon)主要存在3种基因排列模式(图1):①aioAB基因周围存在aioXSR基因,并且aioAB基因与aioXSR基因共转录(代表菌株:Agrobacterium tumefaciens5A);②aioAB基因周围存在aioXSR基因,但aioAB基因与aioXSR基因的转录方向相反(代表菌株:Th iomonas arsenitoxydans);③aioAB基因周围不存在aioXSR基因(代表菌株:Halomonas sp.HAL1)。根据这3类基因排列模式,砷氧化酶基因的表达又存在不同的调控机制。下文将根据研究发表时间,对砷氧化调控机制进行阐述。 2 as调控aioab基因表达 砷氧化酶基因的表达调控较为复杂,在不同条件下,aioAB基因的表达调控机制却不尽相同。最早的相关报道是Kashyap等对A.tumefaciens5A(图1,ClusterⅠ)中砷氧化酶基因在不同加As(Ⅲ)条件下的表达调控机制的研究。aio operon的结构基因为砷氧化酶基因(aio B A),其上游调控基因有编码组氨酸激酶的基因(aioS)和感应调控子的基因(aioR)。aioS和aioR共同组成一套归属于sigma54因子家族的双组分调控系统。当培养基中存在As(Ⅲ)时,细菌的组氨酸激酶AioS会在周质中感应到As (Ⅲ)信号,并产生自身磷酸化作用。磷酸化的AioS会传递磷酸化基团给反应调控子AioR,使之磷酸化,从而调控aio operon的表达。而在缺失了aioR基因的突变株中,aioS基因的表达也会受到严重抑制。因此,aioSR这套双组分调控系统在调控aioAB表达的同时,还会进行自身表达调控砷氧化酶基因aioAB的下游辅助基因有编码细胞色素C(aioC)的基因和钼生物合成辅因子基因(aioD)。研究表明,在A.tumefaciens 5A中,aioSRBACD六个基因是共转录的,并由aioSR双组分调控系统统一调控。 而当培养基中不存在As(Ⅲ)时,砷氧化酶基因aioAB的表达会受到细菌密度感应(quorum sensing)系统的调控。Kashyap等研究发现,当A.tumefaciens 5A在不加As(Ⅲ)条件下生长至对数早期时,aioAB基因不会表达。但将细菌持续培养至对数晚期时,即使培养环境中不存在As(Ⅲ),aioAB基因同样会出现表达现象。而且,在培养至对数早期的细菌培养液中加入乙酸乙酯或对数晚期细菌培养液的上清液,可以诱导aioAB基因的表达。因此推测密度感应也参与了aioAB基因的表达调控。 3 外源融合蛋白的as结合能力和免疫蛋白标记的提出 基于双组分调控的研究基础,发现在很多砷氧化菌的砷氧化基因岛中,双组分调控系统编码基因aioSR的前面存在一个未知功能的蛋白编码基因aioX通过生物信息学分析发现,该蛋白与磷酸盐结合蛋白相似度极高,并且受As(Ⅲ)的上调诱导。研究发现敲除aioX基因,会阻遏砷氧化酶基因aioAB转录表达,并使该菌的砷氧化表型丧失。此外,互补实验证实AioX含有的保守半胱氨酸在砷氧化中发挥着关键作用。通过比较无信号肽的外源融合蛋白AioX及其保守半胱氨酸点突变蛋白C108S的As(Ⅲ)结合能力,证实AioX蛋白是一种新型的As(Ⅲ)结合蛋白,保守半胱氨酸C108可能是结合砷的位点。免疫蛋白印记技术证实AioX蛋白位于细胞周质同时锚定在细胞质膜上,与组氨酸激酶AioS位置接近。