单侧输尿管结核大鼠模型中肾脏病理改变及肾组织间质纤维化表达的变化.docxVIP

单侧输尿管结核大鼠模型中肾脏病理改变及肾组织间质纤维化表达的变化 肾间质纤维是肾疾病发展到最终阶段的一起肾衰竭的共同通道。肾间质纤维化发病机制尚不清楚,慢性肾脏疾病发生后,进行性纤维化和慢性肾衰的发生几乎不可避免,目前临床缺乏治疗良策。建立一种理想的肾间质纤维化动物模型,对于研究肾间质纤维化发生机制以及探寻各种延缓和阻断肾纤维化进展的新方法,具有十分重要意义。本研究采用单侧输尿管结扎(unilateral ureteral obstruction,UUO)的方法快速建立了研究肾脏细胞转分化和肾间质纤维化的理想动物模型。 1 肾组织病理学检测 1.1 实验动物及分组 60只清洁级雄性SD大鼠,体重150~200g,由本校实验动物中心提供。将大鼠随机分为2组,SOR组30只和UUO组30只。 1.2 动物模型的建立 单侧输尿管结扎:5%的水合氯醛腹腔注射将大鼠麻醉后局部剃毛,常规消毒铺孔巾,选择腹正中线切口,依次切开皮肤至腹腔,游离肾脏及输尿管,将左侧输尿管用组织钳托起中段部位,止血钳夹住,在两端用4-0丝线两次结扎左侧输尿管近肾盂段,剪断输尿管,然后连续缝合皮肤。假手术组(SOR)手术入路方式同UUO组,进腹腔后分离左输尿管但不结扎输尿管。随机选取每组中的6只大鼠分别于术后3天、7天、14天、21天和28天处死,处死前一天将大鼠置于代谢笼中(禁食,不禁水),收集24h尿液测尿量,大鼠24h尿经离心(2000 r/min,10min),去除沉渣。水合氯醛麻醉后,右股动脉采血,血液收集后经离心分离出血清。尿液和血清均保存于-20℃冰箱;取左肾组织用4%多聚甲醛固定,石蜡包埋。 1.3 检测方法 1.3.1 生化指标的测定全自动生化分析仪(OLYMPUS AU5400)检测尿蛋白、血清肌酐及尿素氮。 1.3.2 肾脏常规病理检查肾组织经固定,包埋,切成3μm厚石蜡切片,经苏木素-伊红(HE)、过碘酸希夫反应染色(PAS)及马松三色染色(Masson),光镜下观察肾小管间质病变。由两个观察者对每个样本肾组织的HE染色进行盲法评分,取两观察者评分的平均值。 (1)小管间质损伤评分按文献描述的方法,半定量肾小管间质的病变。200倍光镜下,每张切片随机选择10个不含肾小球的视野。肾小管间质病变由3个参数判定(蛋白管型和肾小管的扩张 ;间质炎细胞的浸润;间质纤维化的程度)。每个参数按0~3分评定(0=正常,1=轻度受损,2=中度受损,3=重度受损)。每个样本小管间质的评分为0~9分。 (2)肾间质浸润的炎细胞计数按文献描述的方法,400倍光镜下,每张切片随机选择10个不含肾小球的视野,计数肾间质内浸润的炎细胞(单核巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞)。结果以(炎细胞数/HP×400)表示。 1.3.3 免疫组织化学采用SP法。3μm厚石蜡切片脱蜡水化后经3%H2O2孵育灭活内源性过氧化物酶,高压锅抗原修复,山羊血清封闭后,分别滴加兔抗大鼠FN抗体(武汉博士德公司1∶200),α-SMA抗体(武汉博士德公司1∶150)孵育,再依次加入生物素标记的羊抗兔IgG、辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素工作液孵育。DAB显色,苏木素复染,常规脱水、透明、封片镜检。每次染色均以PBS代替一抗作阴性对照。 1.3.4 图像分析Nickon spot cool CCD采集图像,采用Image Pro plus 4.02多媒体彩色病理图象分析软件进行分析。经灰度变换将阳性染色与背景分开进行自动测量。 (1)肾间质相对面积测定取Masson染色切片,每例切片选取20个不重叠的200倍视野,计算肾间质面积与肾小管间质总面积(去除肾小管管腔)比值,取其平均值为每例切片的肾间质相对面积。 (2)肾小管间质α-SMA、FN免疫组化染色阳性面积测定在每张不包含肾小球和血管的肾小管间质区域随机选取15个不重叠的200倍视野,计算每个视野内阳性染色区域的面积密度平均值。 1.4 统计学处理数据资料用ˉx±s表示,采用SPSS10.0统计软件处理。组间差异采用单因素方差分析(One-way ANOVA)。组间两两比较用SNK检验法。α-SMA、FN表达与肾小管间质损伤评分(TIS)、肾间质相对面积之间的关系判断采用Pearson相关分析。P0.05为有统计学意义。 2 结果 2.1 白定量uio大鼠血尿素氮、胱肌蛋白检测结果 尿蛋白的浓度各个体之间差异较大,但每日排出总量差异较小。24小时尿蛋白定量UUO组与假手术组比较无统计学差异。UUO术后7~14天,大鼠出现明显血尿素氮、肌酐值升高。术后21~28天通过对侧肾脏的代偿,血尿素氮、肌酐值反而下降,但28天时血肌酐值仍然比SOR组高(见表1)。 2.2 炎症细胞+相关组织病理学检测 SOR组各时间点肾脏病理未见改变。UUO术后3天可见肾