DNA甲基化测量技术及准确性评估研究进展.docxVIP

? ? DNA甲基化测量技术及准确性评估研究进展 ? ? 杨 怡, 杨佳怡, 高运华, 董莲华, 杨靖亚 (1.上海海洋大学食品学院，上海201306；2.中国计量科学研究院前沿计量科学中心，北京100029) 1 引 言 表观遗传学是在DNA序列不发生改变的情况下，基因表达可遗传性改变的一门遗传分支学科，主要表现在DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA[1]。其中DNA甲基化是人们深入研究的最重要的表观遗传机制，在许多关键的生物学过程中发挥着重要作用[2,3]。基于测序的DNA甲基化分析为描绘比较完整的DNA CpG图谱奠定了基础。在过去的几十年里，大量DNA甲基化测量技术的涌现使基因组甲基化分析研究得到了极大的发展。但是由于缺乏评估基因组甲基化准确性的相关研究，目前尚不明确基因组甲基化特异性是否如通常识别序列所暗示的那样精确。因此，本文对DNA甲基化测量技术的进展以及甲基化测量的准确评估所存在的问题展开讨论，以期为基因组甲基化测量的准确可比性提供可能的解决方案。 2 DNA 甲基化的概述 DNA甲基化是DNA的一种天然修饰方式，具有多态性、随年龄变化[4]、组织特异性[5]、亲源特异性[6]等特点。其主要是指通过甲基转移酶(DNA methyltransferases，DNMTs)将S-腺苷甲硫氨酸(S-Adenosylmethionine，SAM)提供的甲基转移到DNA的胞嘧啶(C)或腺嘌呤(A)上，对DNA进行修饰而发生的一系列表观遗传现象[7]。研究发现有不同的DNA甲基化修饰，如5-甲基胞嘧啶(5-mC)、5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC)和N6-甲基腺嘌呤(6mA)等，其中最为常见且研究最充分的碱基甲基化是5-mC[8～10]。DNA的甲基化可以调节基因活性并影响许多关键过程，如染色质结构、细胞分化、DNA构象和转录调控[11]。因此，DNA的甲基化也是实现基因沉默和基因印记的重要途径。 3 DNA甲基化的测量技术 DNA甲基化的测量就是用于区分DNA序列中的C和5-mC的能力。检测基因组DNA甲基化水平的方法有很多种，根据目的的不同可分为全基因组和特定位点的DNA甲基化水平测量[12]。但大多数DNA甲基化测量技术均是基于PCR方法，即模板是经亚硫酸氢盐处理过的DNA，根据需求选择引物进行测量。在这里，根据采用其技术类型的不同分为3大类[13]：基于甲基化敏感限制性内切酶(methylation sensitive restriction enzymes，MRE)的测量、基于亚硫酸氢盐的测量和基于亲和富集方法的测量。表1中，对本文所列举的方法进行了归纳对比，后文将对重点关注的测量技术原理以及优缺点进行简要介绍。 表1基于测序的DNA甲基化分析方法对比表Tab.1 Comparison table of DNA methylation analysis methods based on sequencing 3.1 基于MRE的测序 MRE是一组只针对非甲基化DNA片段的酶(如BstU l、Hpa ll、Not l)[13]。根据这一特性将其应用于DNA甲基化的测量，主要原理是利用MRE识别且切割未甲基化C位点，假设未甲基化DNA完全裂解，不能被扩增；甲基化DNA不会被消化从而保持完整，通过DNA扩增来确定基因组甲基化[14]。该方法测定条件温和、操作简单快速。不足之处在于：一是引入了识别位点偏差，分辨率相对较差，并且存在消化不完全而造成的假阳性；二是酶只能识别特定的位点，即识别CpG位点(CCGG)之前的C，不能完全并且准确地反应甲基化全貌。Sun[14]等使用了一种新型的GlaI，其能结合等温指数扩增反应(isothermal exponential amplification reaction，EXPAR)测量出特异性DNA甲基化。GlaI以极好的选择性切割甲基化的靶位点，而保留未甲基化DNA，这与MRE特性完全相反，而暴露出来的甲基化DNA末端片段触发EXPAR，放大了其高效信号。因此，GlaI-EXPAR对测量DNA甲基化具有高度特异性和灵敏性的特点，弥补了传统基于MRE的测量造成假阳性结果的缺陷。然而，GlaI也是一种酶，也只能识别特定的DNA甲基化靶点，不能准确的反映出的全基因组范围的甲基化状态。 3.2 基于亚硫酸氢盐的测量 3.2.1 亚硫酸氢盐测序(BSP) 亚硫酸氢盐测序(bisulfite sequencing PCR，BSP)是目前公认的主流DNA甲基化测量技术之一，是评估DNA甲基化的“金标准”技术。该方法首先是由亚硫酸氢盐处理DNA，使未甲基化的C化学转化为胸腺嘧啶(T)，而甲基化的C保持不变；进而PCR扩增，对PCR产物测序，比较测序结果与未处理序列。因为C只来源于5-mC，由