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生物技术大实验2（酶工程实验） 实验一酶促反响中初速度时间范围测定 一、实验目的 1.认识酶促反响中初速度时间范围测定的基来源理； 2.掌握酶促反响中初速度时间范围的测定方法。 二、实验原理 酸性磷酸酯酶（acidphosphatase,EC）宽泛散布于动植物体中， 特别是植物的种子、动物肝脏和人体的前列腺中。它对生物体内核苷酸、磷蛋白 和磷脂的代谢起侧重要作用。 酸性磷酸酯酶能专一性水解磷酸单酯键。以人工合成的对硝基苯磷酸酯 4-nitrophenylphosphate,NPP）作底物，水解产生对硝基苯酚和磷酸。在碱性溶液中，对硝基酚的盐离子于405nm处光汲取激烈，而底物没有这类特征。 利用产物的这类特征，能够定量的测定产物的生成量，进而求得酶的活力单位。即经过测定单位时间内405nm处光汲取值的变化来确立酸性磷酸酯酶的活性。 酸性磷酸酯酶的一个活力单位是指在酶反响的最适条件下，每分钟生成1μ mol产物所需的酶量。 要进行酶活力测定，第一要确立酶反响时间。而酶的反响时间应当在初速度 时间范围内选择。能够经过进度曲线的制作来求出酶的初速度时间范围。进度曲 线的制作是指在酶反响的最适条件下，采纳每隔一准时间测定产物生成量，以酶 反响时间为横坐标，产物生成量为纵坐标绘制而成。从进度曲线可知，在曲线起 始的一段时间内为直线，其斜率代表初速度。跟着反响时间的延伸，曲线趋于平 坦，斜率变小，反响速度降落。要真切反应出酶活力大小，就应在初速度时间内 生物技术大实验2（酶工程实验） 测定。 三、实验试剂与器械 1.试剂 （1）酸性磷酸酯酶原液（从绿豆芽中提取） （2）酸性磷酸酯酶液（经过原酶液稀释获得） 取原酶液，用0.05mol/L、pH5.0柠檬酸盐缓冲液稀释，使进度曲线中第 号管吸光度A405在0.6～0.7之间。（3）1.2mmol/L对硝基苯磷酸酯 精准称取NPP0.4454g，加缓冲液定容至100mL。 （4）0.3mol/LNaOH溶液 2．器械 恒温水浴槽，可见分光光度计，试管，刻度吸管，离心计。四、操作步骤 1.酸性磷酸酯酶原酶液的制备 称取必定重量的绿豆，浸泡24h，在25～30°C温箱中培育5～7d。长出的 豆芽取其颈部，挨次用自来水和重蒸水冲刷洁净，置滤纸上吸干水分，称30g放 入研钵中匀浆，加0.2mol/L乙酸盐缓冲液4mL，置4°C冰箱中6h以上。而后 用双层纱布挤压过滤，滤液6000r/min离心15min,上清液置透析袋用蒸馏水充 分透析，间隔换水10次，透析24h以上。将透析后酶液稀释至最后体积与豆芽 质量（g）相等，以6000r/min离心30min，所得上清液即为原酶液，置冰箱待 用。 2.酶促反响 生物技术大实验2（酶工程实验） 取试管12支，按表1.1编号，0号为空白。各管加入； 此外2支试管，各加入稀释好的酶液7mL，在酶反响前底物与酶都放入35°C恒 温水浴槽中预热2min。而后向1～11号管内各加入1.0mL预热的酶液。立刻摇 匀并开始计时。准时间间隔为3min、5min、7min、10min、12min、15min、20min、 25min、30min、40min、50min进行反响。待反响进行到上述各相应时间时， 加入3.0mL0.3mol/LNaOH停止反响。冷却后以0号管作空白（0号管加入1.0mL NPP后保温25min，而后加入3.0mL0.3mol/LNaOH，再加入1.0mL酶液）， 在分光光度计上测定各管A405值。 3.数据办理 以反响时间为横坐标，A405值为纵坐标绘制进度曲线。由进度曲线中直线部 分求出酸性磷酸酯酶反响初速度的时间范围。 表1.1 制作酶促反响进度曲线时各物质加入量 试管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 0 NPP（mL） 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 稀释酶液(mL) 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 反响时间（min） 3 5 7 10 12 15 20 25 30 40 50 25 0．3MNaOH(mL) 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 五、实验报告 绘出酶促反响进度曲线，记录实验结果，计算酸性磷酸酯酶反响初速度的时 间范围。 生物技术大实验2（酶工程实验） 实验二过氧化氢酶米氏常数的测定 一、目的 认识米氏常数的意义，测定过氧化氢酶的米氏常数。 二、实验原理 H2O2被过氧化氢酶分解出H2O和O2，未分解的H2O2用KMNO4在酸性 环境中滴定，依据反响前后H2O2的浓度差可求出反响速度。 本实验以马铃薯供给过氧化氢酶，以1/ν-1