骆驼刺单体化合物的制备及其抗人宫颈癌Hela细胞增殖活性的研究.docxVIP

? ? 骆驼刺单体化合物的制备及其抗人宫颈癌Hela细胞增殖活性的研究 ? ? 马晓玲， 刘雪松， 魏鸿雁， 韩莉莉 (1新疆维吾尔自治区中药民族药研究所，乌鲁木齐 830002; 2新疆大学生命科学与技术学院，乌鲁木齐 830046; 3新疆维吾尔自治区人民医院妇科，乌鲁木齐 830002) 骆驼刺(AlhagisparsifoliaShap)是新疆干旱沙漠地区特有的一种落叶灌木，它也是沙漠戈壁“三宝”之一，具有开通阻滞、止咳祛痰、消除异常黏液质等功效，是用于腹痛腹胀、痢疾腹泻、风湿病、滋补强壮、平衡体液和异常胆液质的常见药方[1]。刺糖是骆驼刺在高温干旱环境中由于抗逆性而分泌的糖粒。课题组对乌鲁木齐市郊和乌鲁木齐以北地区的骆驼刺与吐鲁番托克逊县骆驼刺进行了比较，然而近年来由于乌鲁木齐周边等地气候较温和，其骆驼刺已不产生刺糖[2]。因此，本研究采用吐鲁番地区含刺糖骆驼刺作为研究对象。本研究借鉴本课题组前期发现的骆驼刺提取物抗肿瘤和免疫调节的研究基础[3-6]，为了深入探讨骆驼刺提取物对宫颈癌细胞的影响，通过体外培养人宫颈癌Hela细胞，观察骆驼刺提取物和从中分离得到的化合物对宫颈癌Hela细胞增殖(G2期)的影响，明确骆驼刺中具有抗肿瘤活性的成分，为利用骆驼刺活性成分治疗宫颈癌提供实验依据。 1 资料与方法 1.1试剂与仪器 1.1.1 试剂与药材 DMEM高糖培养基(Hyclone 公司)， 胎牛血清(Gibco 公司，FBS)，0.25%胰酶(Hyclone公司)，PBS 缓冲溶液(Thermo公司， 双抗(青霉素-链霉素 PS)，四甲基偶氮盐(Sigma公司，MTT)，5-氟尿嘧啶(上海旭东海普药业有限公司，5-Fu)，硅胶 G 薄层板，硅胶 GF254 薄层板(青岛海洋化工有限公司)，C18柱色谱(大连江申分离科学技术公司)，ODS 制备型色谱柱(YMC公司)，葡聚糖凝胶色谱柱 (sephadex LH- 20，GE Healthcare Bio-Science AB 公司)，色谱甲醇(美国 fisher scientific，色谱纯)，石油醚，甲醇，乙醇，乙酸乙酯，正丁醇，浓硫酸，二甲基亚砜(DMSO)等试剂均为分析纯(天津市致远化学试剂有限公司)。骆驼刺采自新疆吐鲁番地区，经新疆中药民族药研究所王果平副研究员鉴定其为豆科骆驼刺属植物骆驼刺(AlhagisparsifoliaShap.)。 1.1.2 细胞株 人宫颈癌Hela细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库(中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)。 1.1.3 仪器 电热真空干燥箱 DZF-2B (北京永光明医疗仪器厂)，旋转蒸发仪 V-100 (上海爱朗仪器有限公司)，冷却水循环装置 CCA-1111 (上海爱朗仪器有限公司)，循环水式多用真空泵 SHB-III (郑州长城科工贸有限公司)，二氧化碳培养箱 BC-J80S (上海博迅实业有限公司医疗设备厂)，洁净工作台 SW-CJ-2F(苏州尚田洁净技术有限公司)，冷冻离心机 MIKRO 220R (德国Hettich)，酶标仪 BioTeK(上海佛秋乐贸易有限公司)，优普超纯水机 UPT-I-5T/L (成都超纯科技有限公司)，Bruker ARX-300和AV-600型核磁共振仪(德国Bruker Internation AG),高效液相色谱仪(岛津SPD-20A),循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司SHZ-Ⅲ),旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂RE-5210A)。 1.2方法 1.2.1 提取分离 干燥的吐鲁番骆驼刺地上部分(9 kg)，浸泡0.5 h，用70%乙醇回流提取3次(2、1.5、1.5 h)，浓缩得到乙醇提取物(呈浸膏状)1 550 g，乙醇提取物经水分散后(9 L)，分别用等体积石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，得石油醚萃取物(22.4 g)，乙酸乙酯萃取物(93.0 g)，正丁醇萃取物(260.0 g)和水相萃取物(346.8 g)。 1.2.2 不同极性萃取物抗Hela细胞增殖活性的筛选[7-8]将细胞从液氮中取出，迅速置于37 ℃水浴锅中解冻，然后吸入离心管，加入3 mL细胞培养液(10%胎牛血清 DMEM 培养液)，1 000 r/min离心 5 min，弃去上清液，将细胞重悬于1 mL细胞培养液，并转移至 10 cm细胞培养皿中，加入5 mL细胞培养液，混匀后放入细胞培养箱进行培养(37℃、5% CO2)。每2天更换1次培养液，观察细胞形态，维持细胞处于对数生长期备用。 取对数生长期的 Hela细胞，用0.25%胰蛋白酶消化制成单细胞悬液后细胞计数, 将细胞密度调整为6×104个/mL，铺板，培养24 h后给药。空白对照组给予等体积的 PBS；给药组分别