SN_T 3028-2011出口蜂王浆中β-内酰胺残留量测定方法 酶联免疫法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3028—2011出口蜂王浆中B-内酰胺残留量测定方法酶联免疫法Determination of beta-lactam residues in royal jelly for export---Enzyme-linked immunosorbent assay2012-04-01实施2011-09-09 发布中华人民共和国(DX发布国家质量监督检验检疫总局数码防伪 SN/T 3028--2011前 言本标准依照GB/T 1.12009的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国浙江出人境检验检疫局。本标准主要起草人：张晓峰、朱振江、帅江冰、吴姗、陈笑梅。 SN/T 3028---2011出口蜂王浆中β-内酰胺残留量测定方法酶联免疫法1范围本标准规定了蜂王浆中β-内酰胺残留量的酶联免疫测定方法。本标准适用于蜂王浆中萘夫西林氨莘西林-阿莫西林、哌拉西林阿洛西林、氯唑西林、盘尼西林G、双氯青霍素和苯唑西林残留总量的测定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注口期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3原理微孔板中包被有β-内酰胺抗体，加人辣根过氧化酶结合氨苯西林（酶标记氨芋西林）、氨芊西林标准品或样品提取液后，标准溶液中的氨芊西林或样品中的β-内酰胺和酶标记氨芊西林竞争性地与β-内酰胺抗体结合。通过洗涤除去未结合的试剂，然后加入底物显色，用酶标仪测定吸光度，根据吸光度值得出试样中 β-内酰胺的含量。4试剂和材料除另有说明外，所用试剂均为分析纯.水为GB/T6682规霆的级水4.1Randox β-内酰胺检测试剂盒1)4.2稀释洗涤缓冲液：根据β-内酰胺试剂盒中说明，将稀释洗黎缓冲液浓缩液(参见附录 A)以1：9的比例加水稀释，混匀后备用。4.3氨苄西林标准溶液：氨西林冻干粉（参见附录A)用1mL蒸馏水溶解，1 h内使用。4.4酶标记物溶液：根据 β-内酰胺试剂盒中说明，将酶标记物冻干粉（参见附录 A)用1 mL蒸馏水溶解，静置10min后涡旋10min混匀后，立即用酶标记物稀释液（参见附录A）200倍稀释后混勾备用，现配现用。4.550%甲醇:50 mL甲醇用蒸馏水定容至 100 mLc4.630%氢氧化钠：称取30gNa0H溶于100mL水中。4.71 mol/L HCl:取 83 mL分析纯浓 HCl 用蒸馏水定容至1 L。4.8氨苄西林标准物质:纯度≥98%。4.9氨苄西林标准品溶液：用50%乙腈水作为溶剂配制成100ng/mL的储存液，于一20℃条件下保存。1）给出该信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对某一产品的认可。如果其他产品具有相同的效果，需经实验评估后使用这些等效产品。1 SN/T 3028--20114.10空白样品：选用已确切知道不含有β-内酰胺抗生素的蜂王浆样品，作为空白样品，用于随样测试的加标质控试验。5仪器5.1 酶标仪。5.28道移液器:10 μL～100μL。5.3 单道移液器:10 μL～100 μL,100 μL～1 000 μl.和 2 ml～10 mL。5.4混合振荡器。5.5高速冷冻离心机:6 000 r/min。5.6²具塞试管:50 mI。5.7 电子天平:0.01g～100 g。6试样的制备与保存6.1试样的制备原始样品总量不得少于500g，将样品搅拌均匀后分成多个小份，装人洁净容器，加封并做标识。此过程中应尽量减少样品制备时间。每个小份样品只能检测一次，反复冻溶会加速样品中β-内酰胺类的降解。6.2试样的保存将样品于一20℃～18℃条件下保存。7 分析步骤7.1　提取称取5g（精确到0.1g)蜂王浆样品，置于50ml具塞试管中，加人10ml.50%甲醇（4.5），充分混匀，15℃下6000r/min离心10min直至清亮，取0.5mL上清液加人1mL稀释洗涤缓冲液，用30%NaOH(4.6)或1 mol/L HC(4.7)溶液将 pH调节到6.5～7.5，供ELISA检测用，最后稀释倍数为9。7.2测定条件7.2.1操作温度：以下所有操作应在20℃～24℃室温下进行，β-内酰胺试剂盒中所有试剂的温度均应回升至室温(20℃～24℃)后方可使用。7.2.2酶标仪测定条件：酶标仪测定波长为450nm。7.2.3洗板条件：人工洗涤次数5次以上，自动洗板可以预定5次周期，每次注水量为200μl。7.3测定步骤7.3.1测定中吸取不同的试剂和样品溶液时应更换吸头。7.3.2β-内酰胺试剂盒回升至室温后，将测定需用的微孔板（参见附录A）备齐并插人微孔架上，记录标准及样