SN 1358.2-2005马传染性贫血琼脂凝胶免疫扩散试验操作规程.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1358. 2--2005马传染性贫血琼脂凝胶免疫扩散试验操作规程Protocol of agar gel immuno-diffusion test for equine infectious anaemia2005-07-01实施2005-02-17 发布中华人民共和国发布数码防伪国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1358.2—2005言前本标准的附录 A为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准负责起草单位：中华人民共和国山东出人境检验检疫局。本标准主要起草人：杨元杰、朱来华、吴华、韩光来。本标准是首次发布的出入境检验检疫行业标准。 SN/T 1358.2—2005马传染性贫血琼脂凝胶免疫扩散试验操作规程范围1本标准规定了马传染性贫血琼脂凝胶免疫扩散试验操作规程。本标准适用于马传染性贫血抗体水平的检测和诊断。2缩略语下列缩略语适用于本标准。2.1AGID Test:琼脂免疫扩散试验。2. 2EIA：马传染性贫血。3 原理抗原和抗体的分子质量一般都在2×105U以下,抗原及其特异性抗体在凝胶中从高浓度区域向低浓度区域扩散时所受阻力很小，基本上呈自由扩散形式。由于不同抗原分子质量、结构、形状和电荷量不同，因此其扩散系数不同，在凝胶中的扩散速度也不同。当抗原与相应抗体经扩散后在凝胶中相遇，形成抗原抗体复合物，若两者在相遇处比例适当，则形成最大复合物。由于复合物分子质量大，颗粒增大，因此不再继续扩散而产生沉淀，呈现出线状或带状，其形成的线状或带状的“特异性屏障”称为免疫沉淀线或免疫沉淀带，可根据抗原与阳性血清之间出现这种沉淀带，抗原与被检血清之间是否出现沉淀带来判定被检迦清中是否存在抗体。4试剂和材料4.1EIAAGID抗原：由指定单位提供。4.2标准阳性血清和标准阴性血清：由指定单位提供。4.3受检血清：按照常规方法采血分离血清。4℃冷藏保存。4.4磷酸氢二钠(NazHPO·12H,O):分析纯。4.5磷酸二氢钾（KH,PO）：分析纯。4.6氯化钠(NaCI):分析纯。4.7无离子水。4.8硫柳汞：分析纯。4.9琼脂糖:分析纯。5器械和设备5.1培养箱。5.2平皿:规格90 mm×15mm,洁净灭菌。5.3外径5.3mm打孔器（或薄壁型金属管）。5.4坐标纸。1 SN/T 1358.2—20055.5分析天平。5.6 三角烧瓶(250 mL～500 mL)。＇5.7200μL可调微量移液器和吸嘴。6操作方法6.1制备琼脂板6.1.1按照附录 A配制 PBS缓冲液、1%硫柳汞溶液。6.1.2取琼脂糖1g，直接放入含有 0.01%硫柳汞的100mL的PBS缓冲液中，水浴加热融化后,待自然冷却至约56℃时,每个平匪中倒入15mL～18mL琼脂液，厚度约2.5mm左右，注意不要产生气泡，冷凝后加盖，将平Ⅲ倒置，防止水分蒸发，放冰箱中冷藏保存，一周内使用。6.2 打孔反应孔现用现打。在坐标纸上画好7孔图案，把坐标纸放在带有琼脂板的平皿下面，按照图案在固定位置上用金属管(或打孔器)打孔，将切下的琼脂片取出，勿使琼脂膜与玻璃面脱离，为防止渗漏，最好将打孔后琼脂底部经酒精灯火焰上方快速来回5次～7次加热封底。共打7个孔，周围等距离打6个孔，孔距为2.4mm,孔径为5.3mm（见图1）。??00? @图1七孔板6.3加样用微量移液器吸取抗原悬液滴加人中间孔（孔7），3、4孔加人标准阳性血清，1孔、2孔、5孔、6孔分别加人受检血清,加满为止，平皿加盖。待孔中液体吸干后，将平皿倒置，放湿盒内，以防水分蒸发。置15℃～30℃下反应，在24h～48h后，在强灯光暗背景下观察沉淀线。7 结果判定7.1阳性：标准阳性血清孔与抗原孔之间只有一条明显致密的沉淀线，受检血清孔与抗原孔之间形成一条沉淀线；或者阳性血清的沉淀线末端向毗邻的受检血清的抗原侧偏弯者,受检血清可判定为阳性。7.2阴性：受检血清与抗原孔之间不形成沉淀线，或标准阳性血清孔与抗原孔之间的沉淀线向毗邻的受检血清孔直伸或向受检血清孔侧偏弯者，可判定为阴性。7.3可疑：标准阳性血清孔与抗原孔之间的沉淀线末端，似乎向毗邻受检血清孔内侧偏弯，但不易判定时,可将抗原稀释2倍、4倍、6倍、8倍进行复试,重检结果相同应判为阳性。观察可延至5 d。2 SN/T 1358.2—2005附录A(规范性附录)制试剂配A.1 pH 7.4的 0.01 mol/L磷酸缓冲生理盐水(PBS)2.9 g磷酸氢二钠(Na²HPO4·12H2O)0.3 g磷酸二氢钾(KHzPO4)8.0g氯化钠(NaCl)1 000 mL无离子水定容至A.21%的硫柳汞溶液硫柳汞1.0 g100 mL无离子水定容至 I/NS中华人民共和国出入境检验检疫行业标马传染性贫血琼