抗wssv克氏原螯虾胶体金免疫层析试纸条的优化及初步应用.docxVIP

抗wssv克氏原螯虾胶体金免疫层析试纸条的优化及初步应用 白虾病是由非标准白色斑点病毒（wssv）引起的疾病。在第三种和第三十二天内，日本虾的发病率可以达到100%。从1993年首次暴发以来，每年对日本虾业造成重大的伤害。目前, 生产实践中较普遍的通过苗种检疫、生态调控改善养殖环境、饲料中添加免疫增强剂等措施预防控制白斑病发生 目前常用的病原检测方法主要包括普通PCR、实时定量PCR、酶联免疫吸附试验 (ELISA) 和胶体金免疫层析试纸条。普通PCR、实时定量PCR具有较高的灵敏度 1 材料和方法 1.1 病害虾池sis 患白斑病的中国明对虾 (Fenneropenaeus chinensis) 取自青岛附近养殖场的患病虾池。克氏原螯虾 (Procambarus clarkii) 购自青岛某水产品批发市场。抗WSSV单抗杂交瘤细胞株2E6、2A3、3B7、4G9、5D2由本实验室制备 1.2 wssv纯度 取患白斑病中国明对虾的鳃, 每克虾鳃加入TNE缓冲液 (Tris-HCl 1.566g, NaCl 5.844g, EDTA-Na 1.3 细胞培养和渗透 将-80℃冻存的抗WSSV杂交瘤细胞株2E6、2A3、3B7、4G9、5D2放入37℃水浴中迅速融化, 1 000r/min离心3min, 弃去上清液, 加入1mL 37℃的GIT细胞培养基 (日本Nihon Seiyaku公司) , 将细胞重悬、吹匀后, 吸入24孔培养板中 (Corning, USA) , 于37℃下4.5%CO 取腹水按1∶2 (V/V) 加入乙酸缓冲液, 逐滴加入辛酸 (1mL腹水加33μL辛酸) 搅拌30min, 4℃静置2h;经12 000r/min离心30min, 上清液经0.45μm滤膜过滤后, 加入1/10体积的0.1 mol/L PBS, 用1mol/L NaOH溶液调节pH至7.4, 加入饱和硫酸铵溶液使其浓度为45%, 冰浴下搅拌30 min, 4℃静置2h;12 000r/min离心30min, 沉淀用适量0.01mol/L PBS溶解后在4℃下透析3~4次, 每次约4h。SDS鉴定抗WSSV单抗的纯度和类型, 间接免疫荧光技术鉴定单抗的特异性, 间接ELISA测定单抗的效价。 1.4 wssv胶体金免疫分析试剂包的优化 1.4.1 试纸条的制备 用相同的抗WSSV单克隆抗体溶液分别在3种型号的试纸条NC膜 (Whatman AE99、Whatman135、Whatman180, 上海杰一生物公司) 划上检测线, 质控线为羊抗鼠IgG (Sigma) , 待NC膜干燥后, 浸没在3%BSA中于37℃下封闭1h, PBST洗涤3次, 每次5min, 晾干。金标垫用金标抗体Au-2E6浸润后于37℃下干燥。将塑料底板、标签纸、样品垫、金标垫、吸水纸、3种型号的NC膜分别组装成3组试纸条。用这3组试纸条分别检测相同的WSSV溶液, 0.01mol/L PBS溶液作为阴性对照。 1.4.2 试纸条的制备 制备金标抗体Au-2E6和Au-2A3, 将Au-2E6和Au-2A3按不同体积比混合, A组为Au-2E6, B组为Au-2A3, C组、D组和E组Au-2E6和Au-2A3分别按1∶1、2∶1和1∶2混合。将5组金标抗体浸润金标垫后干燥。使用1.4.1中确定的NC膜, 将5种金标垫和其他试纸条耗材组装成5组试纸条。用这5组试纸条检测相同的WSSV溶液, 0.01mol/L PBS溶液作为阴性对照。 1.4.3 检测线抗体最适 将单抗2A3、3B7、4G9、5D2按不同体积比混合, A组2A3∶3B7∶4G9∶5D2=1∶1∶1∶1;B组2A3∶3B7∶4G9∶5D2=2∶4∶2∶1;C组2A3∶3B7∶4G9∶5D2=1∶2∶1∶1;D组为3B7。将这4组混合单抗分别在1.4.1中确定的NC膜上划出检测线, 用1.4.2中确定的金标抗体制备金标垫, 组装成4组试纸条。用这4组试纸条检测相同的WSSV溶液, 0.01mol/L PBS溶液作为阴性对照。 1.5 wssv检测 按照1.4确定的试纸条优化条件制备WSSV胶体金免疫层析试纸条。将1.2中纯化的WSSV溶液从10倍到20 480倍按2倍等比稀释成不同浓度的病毒溶液, 用优化的试纸条分别对其进行检测, 阴性对照为0.01mol/L PBS溶液。 1.6 wssv的培养 实验组和对照组各200只健康克氏原螯虾 (约20g/只) (PCR检测无WSSV感染) 暂养一周后, 水温逐渐升至25℃。实验组投喂注射了WSSV的鲜活花蛤, 对照组投喂不含WSSV的鲜活花蛤。感染后的96h内, 每隔12h各随机选择8只活虾, 取鳃、血淋巴、肠、心脏、性腺、肌肉和肝胰腺。血淋巴按1∶1 (V/