NY_T 1873-2010日本脑炎病毒抗体间接检测酶联免疫吸附法.pdf

ICS 11.220B 41NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 1873--2010日本脑炎病毒抗体间接检测酶联免疫吸附法Indirect ELISA for antibody detection of Japanese encephalitis virus2010-09-01实施2010-05-20 发布中华人民共和国农业部发布 NY/T 1873-—2010前言本标准的附录 A 为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位：中国动物卫生与流行病学中心。本标准主要起草人:陈义平。I NY/T 1873—2010日本脑炎病毒抗体间接检测酶联免疫吸附法1 范围本标准规定了日本脑炎病毒抗体的间接 ELISA 检测技术操作程序。本标准适用于进出口检疫及流行病学调查时对猪血清中日本脑炎病毒抗体的检测。2间接 ELISA2.1材料准备2.1.1器材37℃恒温培养箱、微量移液器、震荡混匀仪、酶标仪、酶标板等。2.1.2包被抗原包被用抗原为日本脑炎病毒囊膜蛋白结构域Ⅲ重组蛋白（re-DⅢ）,经大肠杆菌表达后亲和层析纯化而成。每孔包被量为100 ng。2. 1. 3 阴性对照血清SPF猪血清,经 pH 7.4 的磷酸盐缓冲液(附录 A)1：40 稀释后作为阴性对照血清。2. 1. 4阳性对照血清日本脑炎病毒疫苗免疫健康猪,抗体中和效价达到1：640时采血分离血清,将中和效价为1：640的阳性血清用pH7.4的磷酸盐缓冲液(附录 A)作1：160稀释,即为阳性对照血清。2.1.5包被液、洗涤液、封闭液、酶标抗体稀释液、底物液、终止液配制方法见附录A。2.1.6检测前,先将各种试剂材料平衡至室温。2.2操作方法2.2.1抗原包被以pH 9.6的碳酸盐缓冲液稀释抗原(将re-DⅢ重组抗原稀释至1μg/mL),按每孔100μL包被酶标板,37℃作用2 h 后，洗涤液(PBST)洗板 3次,每次5min。2.2.2封闭每孔加人200uL封闭液，37℃封闭2h，洗板同上。2.2.3加待检血清及对照血清以pH 7.4的磷酸盐缓冲液作为样本稀释液,将待检血清按1：40稀释后100uL/孔加样，每板同时设置两孔阴性血清对照、两孔阳性血清对照,并设一孔空白对照。37℃作用1 h,洗板同上。2.2.4加酶标抗体每孔加人工作浓度的100μL兔抗猪酶标抗体,37℃作用1h,洗板同上。2.2.5加底物液每孔加人底物液100μL，37℃显色作用10min2.2.6加终止液每孔加人100μL终止液终止反应，15min之内测定OD450值。2.2.7 结果判定在酶标仪上读出 OD450的值。以空白值调零,计算阳性对照 OD450平均值、阴性对照 OD450平均值。1 NY/T 1873—2010阴性对照OD45o平均值≤0.2时试验成立。此时，样品OD45o值与阳性对照OD45o平均值比值≥0.35判为阳性；样品OD450值与阳性对照OD45o平均值比值0.35判为阴性。21 NY/T 1873-—2010附录A(资料性附录)溶液的配制A.1包被液(碳酸盐缓冲液,pH 9.6)NaHCO（分析纯)2. 98 gNazCO:（分析纯)1.5g定容至1000mL,混匀。A.2 洗涤液(PBST,pH 7. 4)NaCl(分析纯)8.0gKH2PO4(分析纯)0.2 g2.9gNa2HPO4·12H2O(分析纯)KCI(分析纯)0.2 gTween20(分析纯)0.5 mL0.1g硫柳汞(分析纯)加双蒸水至 1000 mL,调至 pH7.4。A.3封闭液(1%BSA/PBST溶液,pH 7.4)BSA(生物技术级)5g,加 PBST至 500 mL。A.4磷酸盐缓冲液(pH 7.4)8.0gNaCI(分析纯)0.2gKH,PO4（分析纯)2.9 gNa²HPO4·12H2O(分析纯)0.2gKCI(分析纯)0.1g硫柳汞(分析纯)加双蒸水至 1000 mL,调至 pH7.4。A.5酶标抗体稀释液将小牛血清 10 mL加人到 90 mL PBST中,混匀。A.6底物缓冲液(TMB-过氧化氢脲溶液)A.6.1底物缓冲液ATMB(生物技术级)200 g,无水乙醇(或 DMSO)100 mL,加双蒸水至1000 mL。A. 6.2 底物缓冲液 B(0. 1 mol/L柠檬酸-0. 2 mol/ L Na2HPO4缓冲液,pH 5. 0~5. 4)NazHPO414.60 g,柠檬酸9.33g,0.75%过氧化氢尿素 6.4 mL,加双蒸水至 1000 mL，调至 pH5.0~5.4.A.6.3将底物缓冲液 A和底物缓冲液B按1：1混合即成底物缓冲液。3 NY/T 1873—2010A.7 底物液TMB 1mg,1%H²O²25