SN_T 4820-2017牛瓜氨酸血症PCR-DHPLC检测方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4820—2017牛瓜氨酸血症 PCR-DHPLC检测方法Detection method for bovine citrullinemia by PCR-DHPLC2018-03-01实施2017-07-21发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局刮涂层查真伪 SN/T 4820—2017前言本标准按照GB/T1.1--2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局。本标准主要起草人：吴晓薇、朱道中、刘志玲、刘中勇、李贺、马保华、段燕瑜、林志雄。 SN/T 4820--2017牛瓜氨酸血症PCR-DHPLC检测方法1范围本标准规定了牛瓜氨酸血症 PCR-DHPLC的检测方法。本标准适用了快速筛查牛群中隐性的牛瓜氨酸血症(参见附录A)基因携带者。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682-一2008分析实验室用水规格和试验方法3缩略语下列缩略语适用于本文件。CN牛瓜氨酸血症(Citrullinemia)PCR聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction)DHPLC 变性高效液相色谱(Denaturing high-performance liquid chromatography)PBS磷酸盐缓冲液(Phosphate buffer solution)TEAA三乙基铵醋酸盐(Triethylamine acetate)SNP单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism)4原理变性高效液相色谱(DHPLC)是利用目标核酸片段 PCR扩增产物，部分加热变性后，含有突变碱基的DNA序列由于错配碱基与正常碱基不能配对而形成异源双链。因包含错配碱基的杂合异源双链区比完全配对的同源配对区和固定相的亲和力弱，更易被从分离柱上洗脱下来，从而达到分离的目的。SNP的有无最终表现为色谱峰的峰形或数目差异，依据此原理可很容易从色谱图中判断出突变的碱基片段。5仪器设备和试剂耗材5.1仪器设备变性高效液相色谱分析仪。核酸扩增仪。Ⅱ级生物安全柜。恒温水浴锅高速台式离心机（转速可以达到12000r/min）。微量可调移液器（10 μL、100 μL、200 μL、1000 μL）。1 SN/T 4820-2017灭菌配套吸头:10 μL、100 μL、200 μL、1000 μL。肝素钠抗凝管、Eppendorf 管、微量移液器、八联管、移液器、离心管等。5.2试剂与耗材5.2.1试剂级别：本方法试验用水应符合GB/T6682~2008规定的二级水，所用化学试剂均为分析纯。5.2.2DEPC水：按照附录B中B.1制备，推荐使用商品化DEPC处理的无DNA酶和RNA酶的水。5.2.3 0.01 mol/L PBS(pH 7.6),配方见 B.2。5.2.4DHPLC缓冲液,配方 B.3。5.2.5 75%乙醇,配方见 B.4。5.2.6 dNTP:dATP.dTTPdCTP 和 dGTP。5.2.7 pfu 聚合酶。5.2.8酚/氯仿/异戊醇混合液。5.2.910%SDS:配制方法见 B.7。6引物与探针序列上游引物(CN-F)5-GTG TTC ATT GAG GAC ATC-3下游引物(CN-R)5’-CCG TGA GAC ACA TAC TTG-3采用无DNA酶、无RNA酶水将每条引物配制成100 μmol/L储存液，置-20℃保存；使用时取适量配制成10 μmol/L工作液，避免多次冻融。PCR扩增的片段卡度大约为176bp(参见附录C)。7样品采集、保存及运输采集牛的抗凝血，冷藏储存与运输。８DNA提取8.1将血液样品 200μL,加人 2 mL塑料离心管中，加 20 μL蛋白酶K,再加 10% SDS20 μL,混匀。8.2混合液置于55℃水浴2.5h。8.3向勾浆液中按1：1比例加酚/三氯甲烷/异戊醇混合液（25：24：1），轻轻震荡5min后12000r/min离心5 min。8.4吸上层水相400uL于一灭菌塑料离心管中，再次加人等体积酚/三氯甲烷/异戊醇混合液，轻轻震荡混匀5 min，,12 000 r/min离心5 min。8.5吸上层水相500uL于塑料离心管中，加人两倍体积的无水乙醇，20℃放置2h;12000r/min离心5 min，倾去上清液。8.6向DNA沉淀中加人75%乙醇溶液500μL，轻轻混匀后12000r/min离心5min，倾去上清液，室温凉干。8.7向DNA沉淀中加100μL TE缓冲液，