NY_T 1962-2010马铃薯纺锤块茎类病毒检测.pdf

ICS 67.080B 23NY中华人民共和国农业行业标准NY/T1962-2010马铃薯纺锤块茎类病毒检测Detection of potato spindle tuber viroid(PSTVd)2010-12-23发布2011-02-01实施中华人民共和国农业部5发布 NY/T1962—2010前言本标准遵照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部种植业管理司提出并归口。本标准起草单位：农业部脱毒马铃薯种薯质量监督检验测试中心（哈尔滨）。本标准主要起草人：吕典秋、刘尚武、邱彩玲、宿飞飞、王绍鹏、李勇、于德才、张抒、王文重、王亚洲、范国权、李学湛。I NY/T1962-2010马铃薯纺锤块茎类病毒检测1范围本标准规定了马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)的检测方法。本标准适用于马铃薯种薯、商品薯、试管苗及其根、茎、叶不同部位组织中的马铃薯纺锤块茎类病毒的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法方法一聚合酶链式反应3原理类病毒是没有外壳蛋白、裸露的、低分子闭合环状RNA分子，RNA分子大小在246nt～401nt之间，马铃薯纺锤块茎类病毒（PSTVd)的序列在356nt～360nt之间。根据PSTVd序列设计特异性引物，进行扩增，扩增片段大小为359bp左右。4试剂与材料以下所用试剂，除特别注明者外均为分析纯试剂，水为符合GB/T6682中规定的一级水。4.1三氯甲烷。4.2M-MLV反转录酶（200u/μL）。4.3RNA酶抑制剂（40 u/μL)。4.4Taq DNA聚合酶(5u/μL)。4.5焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的水。在100mL水中，加人焦碳酸二乙酯（DEPC)50μL，室温过夜，121℃高压灭菌20min，分装到1.5mLDEPC处理过的微量管中。4.63mol/L乙酸钠溶液（pH5.2)。称取乙酸钠·3H2024.6g，加水80mL溶解，用冰乙酸调pH至5.2，定容至100mL。4.7水饱和酚(pH4.0)。4.8溴化乙锭溶液（10mg/mL）。称取溴化乙锭200mg，加水溶解，定容至20mL。4.91mol/L三羟基甲基氨基甲烷一盐酸(Tris-HCI)溶液(pH 8.0)。称取Tris碱121.1g，溶解于800mL水中，用浓盐酸调pH至8.0加水定容至1000mL，121℃高压灭菌20min。4.10RNA提取缓冲液。称取Tris碱12.12g，氯化钠5.88g，乙二胺四乙酸二钠3.75g，加水至900mL，溶解，用浓盐酸调1 NY/T1962—2010pH至9~9.5，加水定容至1000mL，121℃高压灭菌20min。4.110.5mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液（pH8.0）。称取乙二铵四乙酸二钠186.1g，溶于700mL水中，用氢氧化钠调pH至8.0，加水定容至1000mL。4.125XTris-硼酸(TBE)电泳缓冲液。称取Tris碱27g，硼酸13.75g，量取0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液（4.11)10mL，加灭菌双蒸水400mL溶解，定容至500mL。4.131×Tris-硼酸(TBE)电泳缓冲液。量取5X×Tris-硼酸（TBE）电泳缓冲液（4.12)200mL，加水定容至1000mL。4.14加样缓冲液。分别称取聚蔗糖25g，溴酚蓝0.1g，二甲苯0.1g，加水至100mL。4.155X反转录反应缓冲液。量取1mol/L三羟基甲基氨基甲烷盐酸（Tris-HCI)溶液（4.9)5mL，0.559g氯化钾，0.029g氯化镁，0.154g二硫苏糖醇（DTT），加水定容至100mL。4.1610mmol/L的四种脱氧核糖核苷酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP)混合溶液。4.1710XPCR缓冲液。称取氯化钾3.73g，氯化镁（MgCl2·6H2O)0.30g，溶于70mL水中，加入1mol/L三羟基甲基氨基甲烷一盐酸（Tris-HCI)溶液（4.9)10mL，加水至100mL，121℃高压灭菌20min。4.18TE缓冲液。量取1mol/L三羟基甲基氨基甲烷一盐酸（Tris-HCl)溶液（4.9)10mL,0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液（4.11)2mL，加人水定容至1000mL，121℃高压灭菌20min。4.19引物。Pc:5GGA TCC CTGAAG CGCTCC TCCGAGCCG3°Ph:5CCCGGGAAACCTGGAGCGAACTGG3预期扩增片段为359bp左右。4.20引物缓冲液。用TE缓冲液（4.18)分别将上述引物稀释到20μmol/