蛋白质的性质.pptxVIP

蛋白质的性质第1页/共20页 变性蛋白质空间结构被破坏;生物活性丧失; 物理化学性质发生改变(溶解性降低；粘度增加)一级结构未发生改变；分子量不变易被蛋白酶降解 第4节 蛋白质的性质第2页/共20页 影响蛋白质变性的因素物理因素 高温 紫外 剧烈振荡/搅拌 高压 超声波等化学因素: 酸碱 有机溶剂 尿素等第3页/共20页 蛋白质的沉淀活性蛋白的沉淀 有机溶剂沉淀 硫酸氨沉淀 等电沉淀第4页/共20页 有机溶剂沉淀原理: 破坏蛋白质分子外层水膜，加强蛋白质分子之间的相互作用.常用的有机溶剂: 乙醇 丙酮注意！ 低温下操作 缩短操作时间第5页/共20页 硫酸氨沉淀(盐析)原理: 与自由水分子结合 破坏蛋白质分子的水分子层 加强蛋白质分子之间的相互作用常用的中性盐: 硫酸铵 第6页/共20页 优点： 操作简单 室温下操作 无时间限制 可以通过过滤或透析除去样品中的中性盐第7页/共20页 等电沉淀原理 在pI点，蛋白质分子所带静电荷为0，无静电作用力 实际通常会将等电沉淀与有机溶剂或硫酸铵沉淀结合起来进行第8页/共20页 非活性蛋白的沉淀热凝固： 豆腐 soybean milk boiled magnesium chloride or acid added proteins precipitated重金属： 适宜的pH条件下，蛋白质可以与重金属结合第9页/共20页 生物碱试剂: 苦味酸，三氯乙酸，鞣酸等 当pH低于pI时,蛋白质分子带正电荷，可以与带负电的生物碱试剂发生反应形成沉淀。第10页/共20页 第5节 蛋白质的纯化原理 溶解性 (pI沉淀, 盐析, 有机溶剂, 温度) 蛋白分子大小 (透析, 超滤, 密度梯度,凝胶层析) 电荷 (电泳、离子交换) 特异性的亲和作用(亲和层析)第11页/共20页 蛋白质纯化的步骤蛋白样品的选择预处理 (均质和溶解 )粗提(有机溶剂, 硫酸铵, 等电点)纯化(离子交换, 凝胶过滤, 亲和层析,电泳等)纯蛋白第12页/共20页 S1 蛋白样品的选择蛋白含量丰富来源广第13页/共20页 S2 预处理破碎细胞的途径 均质 超声波 高压 纤维素酶 溶菌酶膜蛋白 以去垢剂破坏膜的脂双层，使膜蛋白完整地释放出来离心第14页/共20页 S3 粗蛋白的制备有机溶剂沉淀硫酸铵沉淀等电沉淀第15页/共20页 S4 蛋白的纯化离子交换凝胶层析亲和层析第16页/共20页 离子交换依据蛋白质分子所带的静电荷来分离阴离子交换层析：用于分离带正电荷的蛋白质分子阳离子交换层析：用于分离带正电荷的蛋白分子通常以NaCl溶液进行蛋白洗脱第17页/共20页 凝胶过滤层析根据蛋白分子的大小进行分离 (分子量)原理: 大的蛋白分子不能进入填充物的孔径中直接从柱底端流出；小的蛋白分子能够进入填充物的孔径中，因而流出柱底端需要的时间更长。估算蛋白质的分子量第18页/共20页 亲和层析原理 蛋白质的配基被固定在不溶性载体上装入柱内. 只有目的蛋白可与配基结合，其它杂蛋白流出柱外. 洗脱纯蛋白第19页/共20页 感谢您的欣赏第20页/共20页