第章DNA重组(限制性内切酶与DNA片段化).pptVIP

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2.7 反应系统 底物:纯,线性,有保护序列 酶:样品,识别序列的密度,容积活性 反应缓冲液 反应条件 当前第31页\共有47页\编于星期六\9点 大部分II型核酸内切酶需要相似的反应条件: Tris-HCl 50 mM pH 7.5 MgCl2 10 mM NaCl 0-150 mM DTT 1 mM Volume 20 -- 100 μl 反应温度、时间 37 ℃,1 -- 1.5 hr 0-50 mM 低盐酶 100 mM 中盐酶 150 mM 高盐酶 当前第32页\共有47页\编于星期六\9点 1) DNA纯度:要求较纯 因素: 蛋白质、乙醇、EDTA、SDS、酚、氯仿以及某些高浓度金属离子 措施: 增加酶的用量;扩大反应系统体积 延长反应时间 ;添加亚精胺 2.7.1 底物 当前第33页\共有47页\编于星期六\9点 2) DNA的甲基化程度 核酸内切限制酶是原核生物限制—修饰体系的组成部分,因此识别序列中特定核苷酸的甲基化作用,便会强烈地影响酶的活性。为避免产生这样的问题,在基因克隆中,质粒DNA是来源于甲基化酶缺陷型的大肠杆菌菌株。 这样制备的质粒DNA,其中的内切酶识别序列没有甲基化,不受限制。 当前第34页\共有47页\编于星期六\9点 3) DNA分子构型 效率:线性DNA分子 大于 超螺旋质粒DNA 环状病毒DNA 当前第35页\共有47页\编于星期六\9点 4)识别序列的侧面序列 限制酶切割DNA,对识别序列两侧的非识别序列有长度要求,只含识别序列的寡核苷酸是不会被酶切的,故通常要在识别序列两侧多加若干个核苷酸 当前第36页\共有47页\编于星期六\9点 试剂公司提供的包装说明书 会标明酶活性单位数和容积活性,最佳作用条件 2.7.2 内切酶 决定酶的用量 酶本身的催化活性 底物DNA的样品 1.用量 当前第37页\共有47页\编于星期六\9点 2 酶活单位 1个酶活单位:在最适反应条件下,在20?l反应液中反应1小时,使1?g ? DNA(标准DNA)完全消化所需的酶活性称为1个单位。(教材P43) 1U核酸内切酶的酶活性:在最佳反应条件下反应1小时,完全水解1μg标准DNA( λDNA )所需的酶量 容积活性:1μL酶液中具有的酶活性单位,即U/μL。 Q:某公司产品——内切酶a标注为200 U/μL,现有提取到50 ug的λDNA,问:在最佳反应条件下反应1小时,需要多少体积的内切酶a? 当前第38页\共有47页\编于星期六\9点 常规缓冲液 pH, Mg++, DTT/β-ME, (10X) pH 7.0-7.9 (at 25℃) Tris-HCl, 乙酸 离子强度: NaCl 高 中 低 100mM 50mM 0 ③ Mg++ 10mM MgCl2 , MgAc 2.7.3 反应缓冲液 对绝大多数限制酶来说,在pH=7.4的条件下,其功能最佳。 当前第39页\共有47页\编于星期六\9点 大多数核酸内切限制酶的标准反应温度都是37℃ 一部分为50-65℃ 少数25-30℃ 高温作用酶于37℃时活性多数10-50% TaqI (65℃) 10% , ApoI(50℃)50% 销售商在产品说明中会标明最佳反应温度 2.7.4 反应温度 当前第40页\共有47页\编于星期六\9点 2.8 star activity 1、概念 高浓度的酶(100U/?g)、高浓度的甘油(5%)、低离子强度(25mM)、极端pH值(pH8.0)等,会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性,即所谓的star activity现象 低特异性:可在不是原来的识别序列处切割DNA 是限制内切酶的一般性质,任何一种限制酶在极端非标准条件下都能切割非典型位点 当前第41页\共有47页\编于星期六\9点 2、抑制star activity的措施 ① 减少酶的用量,避免过量酶切,减少甘油浓度 ② 保证反应体系中无有机溶济或乙醇 ③ 提高离子强度到100~150mM (如果不会抑制的话) ④ 降低反应pH至pH7.0 ⑤ 使用Mg++作为二价阳离子 当前第42页\共有47页\编于星期六\9点

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