DB21_T 3054-2018犬巴贝斯虫荧光定量PCR检测方法.pdfVIP

ICS 11.220 B 41 备案号：62083-2019 DB21 辽 宁 省 地 方 标 准 DB21/T 3054—2018 犬巴贝斯虫荧光定量PCR 检测方法 Detection of fluorescent quantitation PCR for Babesia canis DB21/T 3054—2018 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009 给出的规则起草。 本标准由辽宁省畜牧兽医局提出并归口。 本标准起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心、辽宁省动物医学研究院。 本标准主要起草人：高志峰、张才、杨国丽、邓文超、张健、马建山、高原、兰德松。 II DB21/T 3054—2018 犬巴贝斯虫荧光定量PCR 检测方法 1 范围 本标准规定了犬巴贝斯虫的荧光定量PCR检测方法的技术要求，包含规范性引用文件、缩略语、原 理、仪器和器材、试剂和引物、样品的采集和前处理、操作步骤、检测过程中防治交叉污染的措施、废 弃物处理等。 本标准适用于在生物安全Ⅱ级（BSL-2）以上的实验室进行全血液样品中犬巴贝斯虫核酸的检测， 适用于犬巴贝斯虫病的确诊及流行病学调查。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 19489 实验室生物安全通用要求 GB/T 19495.2 转基因产品检测 实验室技术要求 中华人民共和国农业部公告2003年第302号《兽医实验室生物安全技术管理规范》 中华人民共和国农业部公告2017年第25号 《病死及病害动物无害化处理技术规范》 3 缩略语 该部分对本技术规范中用到的缩略语进行了注解： DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid） bp：碱基对（base pair） PCR：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction） dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（Deoxy-ribonucleoside triphosphate） Taq酶：Ex Taq DNA聚合酶（Taq DNA polymerase） TAE：三羟甲基氨基甲烷-乙酸电泳缓冲液（Tris acetate-EDTA buffer） 4 原理 巴贝斯虫病是指由巴贝斯科的原虫所引起的一种梨形虫病，主要以侵害家畜的红细胞为特征的血液 原虫病。犬巴贝斯虫病是一种经硬蜱传播的血液原虫病，临床上以严重贫血、高热、黄疸、呼吸困难为 特征。根据犬巴贝斯虫（Babesia cains, B. canis）裂殖子基因序列设计一对引物，在DNA聚合酶催化 下，以母链DNA为模板，以引物为延伸起点，通过变性、退火和延伸，体外复制出与母链模板DNA互补的 子链DNA。 5 仪器和器材 1 DB21/T 3054—2018 5.1 低温高速离心机（最大离心力12 000 rpm）. 5.2 冰箱：4℃±1℃冰箱，-20℃±1 ℃冰箱，-70℃±1℃冰箱。 5.3 生物安全柜。 5.4 荧光PCR 扩增仪。 5.5 分析天平。 5.6 离心管