分子生物学实验设计蚕豆病GPD临床诊断医学生生化代谢实验室检查结果.pptxVIP

分子生物学实验设计蚕豆病GPD临床诊断医学生生化代谢实验室检查结果第1页/共19页第2页/共19页案例： 患儿，男性，3岁，因面色苍白伴血尿1天入院。1天前食用新鲜蚕豆后，今日出现恶心、呕吐、排尿呈酱油样色，面色苍白。据家长反映，患者的姐姐也曾发生过类似情况。临床表现：1 体温38℃，脉搏150次/分，呼吸40次/分，血压 80/60mmHg，呼吸急促2 皮肤及巩膜黄染，体型较同龄人瘦小。3 心、肺未及异常，肝、脾未触及，双肾区无叩击痛，神经系统检查未及异常。第3页/共19页实验室检查：病例样本标准值意义红细胞1.98×1012/L4.3~4.5×1012/L↓血红蛋白53g/L12~14g/L↑血清总胆红素85.5μmol/L5.13~18.8μmol/L↑结合胆红素13.7μmol/L1.71~6.84μmol/L↑未结合胆红素71.8μmol/L3.42~11.96μmol/L↑尿蛋白（++）（—）轻度蛋白尿潜血（+）（—）血管内溶血尿胆红素（—）（—）—尿胆素原（+）少量↑胆红素形成↑ 尿胆素原↑第4页/共19页1.根据上述患儿的临床表现和实验室检查，初步判断患儿是何种疾病？初步诊断：蚕豆病，伴溶血性黄疸发病原因：遗传因素；由于G6PD基因突变，导致该酶活性降低，红细胞不能抵抗氧化损伤而遭受破坏，引起溶血性贫血。第5页/共19页2.请设计实验进一步明确诊断。要求：实验名称，实验方法，主要试剂和仪器，实验操作流程及注意事项，结果如何分析。紫外法测G6PD活性【实验原理】 G6PD活性的表示方法常用U/L、U/g Hb两种形式。其中U/g Hb定义为：每克Hb在25℃的环境中每分钟产生1umol NADPH为一单位（U）。G6PD催化G6P脱氢生成NADPH。NADPH在340nm处有最大吸收峰，Hb被氧化成高铁Hb后在540nm处有最大吸收峰，通过比色法可以计算出NADPH及Hb的含量，从而推算出G6PD的比活性。第6页/共19页【实验器材】恒温水循环紫外分光光度计、可见分光光度计、离心机【主要试剂】0.5mol/L Tris-HCl MgCl2缓冲溶液（pH8.0）、2mmol/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP﹢）、 6mmol/L葡萄糖-6-磷酸二钠（G6P-Na2）、溶血剂、血红蛋白氧化试剂、0.9NaCl，ACD抗凝剂。第7页/共19页【结果与分析】1、NADPH产量的计算: NADPH产量（μmol）=△A340／6.222、血红蛋白含量的计算: Hb含量（mmol）= A540/443、G6PD比活性（U/g Hb）的计算:G6PD比活性单位（U/g Hb）= (△A340／A540) ×49.85【参考范围】正常值：大于2.8U/g Hb。第8页/共19页【实验步骤】1、洗涤红细胞2、溶血液的制备3、NADPH的测定4、溶血液中血红蛋白含量的测定第9页/共19页【注意事项】1、洗涤红细胞时禁止剧烈震荡，避免溶血。2、测定NADPH时读取吸光度的时间要准确。【备注】样本采集须知1、病人准备：空腹 2、采样时间：清晨 3、样本容器：一次性采血管4、抗凝剂：首选肝素，其次EDTA-K2、枸橼酸钠。 5、采样的方法和步骤：按常规静脉采血法，采样后立即充分混匀，避免产生气泡，气泡会导致溶血。第10页/共19页【 G6PD缺陷筛查】【实验名称】葡萄糖—6—磷酸脱氢酶的荧光斑点试验G6PD【实验原理】 6-磷酸葡萄糖6-磷酸葡萄糖酸 NADP NADPH还原长波紫外光365nm的激发荧 光【实验方法】基于NADPH可发出荧光，6-磷酸葡萄糖和NADP加入到测试细胞 的溶血产物中，经短暂孵育后，混合物在滤纸上出现斑点，在长波紫光下检测，荧光表明NADP的存在。第11页/共19页【试剂和仪器】6-磷酸葡萄糖钠盐、辅酶Ⅱ钠盐、三羟基氨甲烷（Tris）、浓盐酸、皂素溶液、氧化型谷胱甘肽、蒸馏水【实验操作流程】混合试剂的成分与配方：0.01mol/L 6-磷酸葡萄糖钠盐 取6-磷酸葡萄糖钠盐3.05mg溶于1ml蒸馏水中7.5mmol/L 辅酶Ⅱ溶液（NADP） 取辅酶Ⅱ 钠盐6.379mg，加蒸馏水至1ml0.75mol/L pH7.8Tris-HCL缓冲液 取三羟基氨甲烷（Tris）4.5428g, 加浓盐酸2ml调整pH为7.3, 加蒸馏水至50ml备用. 用时取3ml10g/L 皂素溶液2ml8mmol/L 氧化型谷胱甘肽液 氧化型谷胱甘肽2.45mg, 加蒸馏水到1ml蒸馏水2ml将以上6种液体混合,分装后置 -20℃保存第12页/共19页2.标本采集:肝素化毛细血管从手指采集