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蝉花真菌液体发酵及活性成分测定 　　摘要：利用蝉拟青霉（paecilomycescicadae）菌株进行液体发酵，并进行单因素和正交试验，以实现蝉花真菌液态发酵条件包括ph值、温度、摇床转速、培养基装液量的优化。结果表明，蝉花液体发酵的最优条件为ph值7.4、摇床转速150r/min、温度28℃、装液量40%;在此条件下，测得的真菌多糖含量为107.45mg/g，虫草酸含量为95.82mg/g，真菌多糖、虫草酸含量皆高于天然蝉花。 　　关键词：蝉花;液体发酵;活性成分;测定 　　中图分类号：s567.3+50.1;s188+.4 　　文献标志码：a 　　文章编号：1002-1302（2020）02-0197-04 　　收稿日期：2018-10-29 　　作者简介：黄小忠（1981—），男，江苏海安人，硕士，讲师，主要从事发酵工程研究。e-mail：huangxiaozhong@jsafc.edu.cn。 　　通信作者：谢春芹，副教授，主要从事食药用菌研究。e-mail：xiechunqin@jsafc.edu.cn。 　　蝉花（cordycepscicadae），别称大虫草，属虫生真菌，与冬虫夏草有非常接近的亲缘关系，属麦角菌科（clavicipttaceus）虫草属（cordyceps），在我国，蝉花主要分布在四川省、江苏省、浙江省、福建省等地[1]。 　　国内外多项研究成果表明，蝉花具有多种保健作用，包括提高人体自身免疫力、抗疲劳、养肾、养肝、改善睡眠、抗肿瘤、抗辐射和明目等，是一味具有神奇效果的古老中草药[2]。李时珍在《本草纲目》中记载的药效为：“蝉花可治疗惊痫，夜啼心悸，功同蝉蜕”。蝉花的天然成分与冬虫夏草类似，具有相同的药用价值，且尚未检测出有毒重金属如碘、汞、铅等，在安全性方面蝉花显然优于冬虫夏草，同时蝉花的价格相对于冬虫夏草而言较低，因此蝉花常作为冬虫夏草的替代品。 　　蝉花对生长条件要求比较严格，需要特定的生态环境和寄主昆虫（金蝉）[3]，这是蝉花资源稀少的主要原因。近几年随着生态环境的破坏，蝉花的生长区域大范围缩小;同时人们开始认识到蝉花的价值，使蝉花遭到了疯狂的采摘，导致蝉花资源迅速减少。本试验的目的是利用蝉拟青霉（paecilomycescicadae），在经优化的液态培养条件下生产蝉花菌丝体，并对菌丝体的生物活性物质进行提取及测定分析，以期通过菌丝体发酵来获得天然蝉花含有的药用活性物质，为规模化生产提供参考。 　　1材料与方法 　　1.1蝉花菌种来源 　　蝉花（cordycepscicadae）菌株来自江苏省食用菌研究所。 　　1.2试剂与仪器 　　1.2.1试剂甘露醇标准品、乙酸铵、冰醋酸、乙酰丙酮、高碘酸钠、l-鼠李糖、葡萄糖、蔗糖、蛋白胨、酵母膏、琼脂、孟加拉红染色剂、氯霉素、k2hpo4、kh2po4、mgso4·7h2o、高碘酸钾、苯酚、浓硫酸、无水乙醇。 　　1.2.2仪器水浴恒温振荡器;电子天平;立式压力蒸汽灭菌器;数显恒温水浴锅;可见分光光度计;冷冻真空干燥机。 　　1.3培养基 　　1.3.1菌种保藏培养基pda斜面试管培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g，加水至1l，ph值自然，在121℃下滅菌30min备用。 　　1.3.2种子培养基土豆200g、蔗糖50g、豆粕5g、kh2po45g、mgso4·7h2o0.5g，加水至1l，ph值自然，在121℃下灭菌30min备用。 　　1.3.3发酵培养基蔗糖40g、蛋白胨15g、kh2po41.5g、mgso4·7h2o0.5g，加水至1l，在121℃下灭菌30min备用。 　　1.4发酵种子的制备 　　1.4.1菌种活化将试验分离所得到的在低温保藏的蝉花菌种通过无菌操作接种于pda平板培养基上，在温度为28℃条件下培养2～3d进行活化，当菌丝长满整个培养皿时，即可使用[4]。 　　1.4.2孢子悬浮液的制备在无菌条件下，用接种钩从培养基上取大小约0.3cm×0.3cm的母种块，接种于盛有100ml种子培养基的250ml三角瓶中（菌块稍带培养基且要薄，以能浮在培养液表面为最佳），在温度为28℃，转速为180r/min的恒温摇床中培养72h[5]。 　　1.5液体发酵条件的确定 　　1.5.1发酵温度的优化取5ml菌悬液，接入装液（发酵培养基）量为40%的250ml三角瓶中，将恒温摇床的温度分别设为22、25、28、31、34℃，摇床转速设为150r/min，培养5d后测其生物量。 　　1.5.2发酵ph值的优化取