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原核表达步骤 Chi l 原核表达基本试验步骤 将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的 方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面 都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制； 用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的 大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是，在 大肠 杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工 ，常形 成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。 表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质 粒，典型的表达载体应具有以下几种元件： (1) 选择标志的编码序列； (2) 可控转录的启动子； (3) 转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)； (4) 一个多限制酶切位点接头； I____________________________________________________ I (5) 宿主体内白主复制的序列。 .I I 原核表达一般程序如下：获得目的基因-准备表达载体-将目的基 因插入表达载体中(测序验证)-转化表达宿主菌-诱导靶蛋白的表达 一表达蛋白的分析一扩增、纯化、进一步检测，其中包括： 一、试剂准备 (1) LB 培养基。 (2) 1MIPTG(异丙基硫代-6-D-半乳糖昔)：2.38g IPTG 溶于 10ml ddH2O 中,0.22 p m 滤膜抽滤，-20 C 保存。 CCY 勺IPTG 是1M 的，用时进行1000 倍稀释。 二、操作步骤 （一） 获得目的基因 1、通过PCR 方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计 一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点）， PCR 循环获 得所需基因片段。 2、通过RT-PCF^法：用TRIzol 法从细胞或组织中提取总 RNA 以mRNA 为模板，逆转录形成cDNA 第一链，以逆转录产物为模板进行 PCRW 环 获得 产物。 （二） 构建重组表达载体 1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行 双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收 Kit 或冻融法回收载体大 片段。 2、PCR 物双酶切后回收，在T4DN 避接酶作用下连接入载体。我们用 Soultion I 连接。 （三） 获得含重组表达质粒的表达菌种 1、 将连接产物转化大肠杆菌 BL21,根据重组载体的标志（抗Amp^蓝 白斑） 作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。 2、 测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确 ，进入下步操作。 否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。 3、 以此重组质粒DNA 专化表达宿主菌的感受态细胞。 （四）诱导表达 1、 挑取含重组质粒的菌体单斑至 2ml LB （含kana 50 g/ml ）中37 C 过夜 培养。 2、 按1 ： 100 比例稀释过夜菌，一般将 2ml 菌加入到含200mlLB 培养 基 ， 培养瓶中 37C 震荡培养至OD00.4-1.0 （最好0.6 ,大约需3h-4h 。我用3.5h , 有 0.66-0.69 ） 。 ， 3、取部分液体作为未诱导的对照组 余下的加入IPTG 诱导剂作为实验 组， 终浓度为1mM 两组继续37C 震荡培养3hr 。nsp2 诱导4 小时，比较好，3 小 时表达量较低。 4、离心4500gx 30min 收获沉淀。 5、加 25ml 50 mM PBS （pH 7.4 ）洗 1 次 6、转到 50ml 离心管 8000rpm 10min。 7、加入1/10 体积的50 mM PBS （不可溶细菌加8M 尿素50 mM PBS 重 悬 。 细菌。超声破碎（300W4 S/4S,99 次） 超声后液体变清澈。超声时 探头离 管底一定距离，防止管破裂。 8、12000g, 10min,取上清作为待纯化的样品。 9、 混匀镣柱，根据培养物