温补肾阳药对肾上腺切除的肾阳虚大鼠肝线粒体蛋白质组的影响（职称论文资料）.docVIP

温补肾阳药对肾上腺切除的肾阳虚大鼠肝线粒体蛋白质组的影响（职称论文资料） 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：温补肾阳药对肾上腺切除的肾阳虚大鼠肝线粒体蛋白质组的影响 1 1实验材料 2 2研究方法 3 3结果与分析 5 文2：谈述寒凉药对热证大鼠肝线粒体蛋白质组的影响 9 1材料与策略 9 3分析与讨论 11 参考文摘引言： 13 原创性声明（模板） 14 文章致谢（模板） 15 正文 温补肾阳药对肾上腺切除的肾阳虚大鼠肝线粒体蛋白质组的影响（职称论文资料） 文1：温补肾阳药对肾上腺切除的肾阳虚大鼠肝线粒体蛋白质组的影响 肾阳虚证是指由于肾阳虚衰，温煦失职，气化失权所表现的一类虚寒证候。许多学者认为肾阳虚与神经－内分泌紊乱有关，肾阳虚病人垂体-肾上腺皮质功能降低和垂体-甲状腺功能降低[1-2]，临床主要表现为腰膝酸软、畏寒肢冷、头晕目眩、精神萎靡、面色白、舌淡苔白和脉沉细等。临床上用温肾助阳药治疗后可改善脾肾阳虚症状，使基础代谢升高。本实验采用两侧切除肾上腺方法造成肾阳虚模型大鼠，利用凝胶内差异显示电泳技术（differential in-gel electrophoresis，DIGE）和质谱技术，建立肾阳虚模型大鼠及温补肾阳药治疗组大鼠肝线粒体双向电泳图谱，并进行差异蛋白质组分析，从蛋白质表达水平上以动态的、整体的角度阐述中医温补肾阳药作用的分子基础，最终指导中医临床治疗。 1实验材料 温补肾阳药仙茅10g，淫羊藿10g，肉苁蓉15g，附子6g，干姜6g，由浙江省中医院中药房提供，常规水煎2次，合并煎液，浓缩至/mL，冰箱内保存待用。 实验动物8只SD大鼠，体重（280±20）g，购自浙江中医药大学实验动物中心，随机分为2组（模型组和治疗组），每组4只，于室温下饲养3天，控制空气干湿度，随意饮水和进食。经过适应期，切除大鼠两侧肾上腺，喂养6天后大鼠出现饮食明显减少、体重减轻、反应迟钝、拱背耸毛、毛色无光泽、有脱毛现象，大便稀溏等症状。从第7天开始，治疗组喂饲温补肾阳药煎剂/只，连续6天，模型组喂饲同样量的生理盐水。 主要的试剂丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、尿素、硫脲、甘氨酸、TRIS、CHAPS、SDS、碘乙酰氨、固相pH干胶条(IPG strip pH3-10，NL，24cm)，Ampholyte pH 3-10，2D clean up试剂盒，蛋白质定量试剂盒均为美国GE healthcare公司产品。所有溶液均用MilliQ水配制。 主要仪器EttanTM IPGphorTM等电聚焦电泳仪，EttanTM DALTSix垂直板电泳仪，Typhoon 9400多功能荧光扫描成像系统，DeCyder Image QuantTM 凝胶图像分析软件，均为GE healthcare公司产品。串联质谱仪（MALDI TOF-TOF 4800）为美国ABI公司产品，P80MX超速冷冻离心机为日本HITACHI公司产品。 2研究方法 肝线粒体蛋白制备最后一次喂药后1h，断头处死动物，取肝脏用/L蔗糖冲洗两次，在4℃ 1/10(w/v)体积pH 的MSHE缓冲液(/L甘露醇，/L蔗糖， /L EGTA，%牛血清白蛋白，2mmol/L Hepes/KOH )中匀浆，600g离心5 min后取上清，再经10300g离心10min，沉淀物重悬于5mL MSHE，加到20mL含30% Percoll的纯化液中（225mmol/L甘露醇，1mmol/L EGTA，25mmol/L Hepes，%牛血清白蛋白），于95000g离心30min，收集密度/mL之间的悬液，加入40mL MSHE，于6300g离心10min以去除Percoll。并用150mmol/L KCl和MSHE分别洗涤两次[3]，加入1mL裂解液（30mmol/L Tris， 8mol/L尿素，4% CHAPS，），4℃孵育2h。置冰上超声，超声后用12000g离心30min，取上清用2-D clean up kit 去杂质，并用2-D定量试剂盒测定蛋白质浓度，分装成10μg/μL， 置-80℃保存。 荧光标记蛋白质将CyDye (Cy2，Cy3，Cy5)从-20℃取出，室温放置10min，加入25μL二甲基甲酰胺，涡旋混匀，12000g离心30s，取出2μL配成200pmol/L的工作液，每个样品各取50μg蛋白质，调节pH至，分别加入400pmol相应的染料，振荡混匀，冰上避光孵育30min，加入1μL 10mmol/L赖氨酸中止反应，剧烈振荡，冰上避光放置10min，加入2倍体积缓冲液（8mol/L尿素，130mmol/L DTT， 2% CHAPS，2% pH3-10的P